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双荧光T-RFLP方法的建立及应用
摘要
双荧光T-RFLP方法是一种高通量的分子生物学方法，可以用于研究微生物群落差异性和多样性。该方法基于T-RFLP技术，结合荧光标记，能够同时检测两个不同荧光信号的终端限制片段，具有比传统T-RFLP方法更高的分辨率和准确度。本文通过文献调研，阐述了双荧光T-RFLP方法的建立和应用，重点介绍了其在环境微生物学研究中的应用，如微生物群落结构分析和多样性评估等。
关键词：双荧光T-RFLP；终端限制片段长度多态性；微生物群落结构分析；多样性评估
Abstract
Dual-fluorescenceT-RFLP(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism)isahigh-throughputmolecularbiologytechniquethatcanbeusedtostudythediversityanddifferenceofmicrobialcommunities.ThismethodisbasedonT-RFLPtechnologyandcombinedwithfluorescencelabeling,itcansimultaneouslydetecttwodifferentfluorescentsignalsofterminalrestrictionfragment,whichhashigherresolutionandaccuracythantraditionalT-RFLPmethod.Inthispaper,throughliteratureresearch,weelaboratedtheestablishmentandapplicationofthedual-fluorescenceT-RFLPmethod,focusingonitsapplicationinenvironmentalmicrobiologyresearch,suchasmicrobialcommunitystructureanalysisanddiversityevaluation.
Keywords:dual-fluorescenceT-RFLP;terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism;microbialcommunitystructureanalysis;diversityevaluation
1.引言
微生物是环境中广泛存在的生物体，对环境的生态平衡和营养循环具有重要作用。随着分子技术的发展，建立微生物群落结构分析和多样性评估方法，对了解微生物生态学和环境微生物学问题具有重要的意义。其中T-RFLP技术是一种广泛应用于微生物群落结构鉴定的分子生物学技术，其基本原理是通过PCR扩增细菌16SrRNA基因或真菌ITS序列，然后对PCR产物进行限制性内切酶酶切，测定终端限制片段的长度，通过长度特征图连锁关系研究不同微生物群落的差异。然而，传统的T-RFLP技术存在一些缺点，如缺乏重复性、低灵敏度和分辨率，且不能同时检测多个细菌属或物种的区别。
因此，近年来科学家们针对传统T-RFLP技术的不足，开发了一种新型的基于双荧光标记的T-RFLP技术，即双荧光T-RFLP技术。该技术可以同时检测两种不同荧光信号的终端限制片段，提高了分辨率和准确度。双荧光T-RFLP技术可以被广泛应用于环境微生物学研究中，例如微生物群落结构分析和多样性评估等领域。
本文通过文献调研，详细阐述了双荧光T-RFLP技术的原理和建立方法，并介绍了其在环境微生物学研究中的应用。同时，我们探讨了应用双荧光T-RFLP技术研究微生物群落结构和多样性评估的优势和局限性，并对该技术的未来发展进行了展望。
2.原理及建立方法
2.1双荧光T-RFLP技术原理
双荧光T-RFLP技术是在传统T-RFLP技术的基础上增加了双荧光标记，实现了两个不同荧光信号的终端限制片段的分析。其原理图如图1所示。
图1双荧光T-RFLP技术原理图
（1）双荧光标记方案的选择：双荧光标记方案的选择是建立双荧光T-RFLP技术的关键。一般情况下，通过挑选距离PCR引物2-4bp的限制性内切酶和荧光标记物的位置，设计用于PCR扩增的引物，从而确保PCR扩增物仅带有单一限制性内切酶的切割位点，同时引物上的荧光标记物也应该能够被读取仪器准确测定。在双荧光T-RFLP技术中，通常使用6-FAM和HEX两种荧光染料完成引物标记，分别标记在不同PCR引物的5’端。
（2）PCR扩增及限制酶酶切：PCR反应体系依据常规的含量组建并根据样品要求扩增目的基因，PCR扩增产物互补链上特异性的限制性内切酶切位点；随后，将PCR扩增产物通过限制酶切，得到不同长度的终端限制片段。在终端限制片段的末