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乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
摘要
本文旨在通过对乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆并将其在大肠杆菌中表达，以探究其在生物工程和食品工业等领域的应用。首先，通过PCR技术将乳酸乳球菌的α-乙酰乳酸合成酶基因克隆到载体pUC19上，并经酶切和测序鉴定。随后，将其转入大肠杆菌中进行表达，并通过SDS-PAGE和Westernblot检测表达情况。结果表明，成功克隆了乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因，并在大肠杆菌中成功表达，为后续应用奠定了基础。
关键词：乳酸乳球菌；α-乙酰乳酸合成酶；基因克隆；大肠杆菌；表达
Introduction
乳酸乳球菌是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性菌，是乳制品工业和生物工程领域的重要微生物，具有十分广泛的应用前景。其中，α-乙酰乳酸合成酶是乳酸乳球菌中的一种重要酶类，可以将乳糖或果糖转化为α-乙酰乳酸，是乳酸发酵中乳酸生产的主要酶。
为了深入探究乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶的结构和功能，并为其在工业应用中提供更好的服务，本研究选择了常用的大肠杆菌作为表达宿主，利用PCR技术克隆了乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因，并将其成功表达在大肠杆菌中。
MaterialsandMethods
1.材料
优良的乳酸乳球菌菌株和常用的大肠杆菌胞株、pUC19载体以及所需酶切酶、PCR反应仪等。
2.提取基因组DNA
先将乳酸乳球菌进行培养，利用常规的基因组DNA提取方法提取其基因组DNA，并采用电泳法检测其纯度、质量、完整性和浓度。
3.克隆乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因
根据NCBI数据库中已有的α-乙酰乳酸合成酶基因序列确定引物序列，利用PCR方法克隆乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因，PCR反应条件为：95℃2min，95℃45s，56℃45s，72℃45s，35个循环，72℃5min，并经酶切和测序鉴定。
4.将乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因转入大肠杆菌中
通过PCR方法，添加限制性内切酶切位点，然后利用T4DNA连接酶将克隆好的α-乙酰乳酸合成酶基因与载体pUC19连接起来，筛选出重组质粒。利用外源质粒介导转化法将重组质粒转入大肠杆菌中，并筛选出抗性菌落。
5.SDS-PAGE和Westernblot检测表达情况
采用SDS-PAGE方法对表达的蛋白进行检测，利用Westernblot方法检测蛋白的免疫活性，以验证乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因在大肠杆菌中的表达情况。
ResultsandDiscussion
1.乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆
通过PCR技术，从乳酸乳球菌中成功克隆出了α-乙酰乳酸合成酶基因，其电泳图如图1所示：
图1.PCR扩增得到的乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因片段
2.将乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因转入大肠杆菌中
将重组质粒转入大肠杆菌中，筛选出抗性菌落，经PCR检测，筛选出含有正确插入片段内的克隆菌，如图2所示：
图2.经PCR验证得到的重组质粒
3.SDS-PAGE和Westernblot检测表达情况
通过SDS-PAGE方法和Westernblot方法，检测表达的蛋白，结果显示，蛋白质的分子量和免疫活性均与预期相符，如图3和图4所示：
图3.SDS-PAGE方法检测表达的蛋白
图4.Westernblot方法检测表达的蛋白
结论
通过PCR技术将乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因克隆到载体pUC19上，并经酶切和测序鉴定。随后，将其转入大肠杆菌中进行表达，并通过SDS-PAGE和Westernblot检测表达情况。结果表明，成功克隆了乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因，并在大肠杆菌中成功表达，为后续应用奠定了基础。
参考文献
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