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两型豆光敏色素基因PHYB的克隆与表达载体构建
摘要
光是植物生长发育的重要因素，可以影响植物的某些发育和环境适应性状。植物的光输入主要由红外光谱和红色光谱组成，而植物的两型豆光敏色素基因PHYB是调节植物对这两种光谱的敏感性和反应性的重要因素。本研究利用PCR技术，从植物基因组中克隆了两型豆光敏色素基因PHYB，然后将其克隆到表达载体pUC19中，构建了表达载体pUC19-PHYB。通过DNA测序和蛋白质表达分析，证实了所构建表达载体pUC19-PHYB的正确性，在进一步的研究中将对植物的生长发育有重要的应用价值。
关键词：两型豆光敏色素基因；PCR技术；表达载体；生长发育。
引言
光是影响植物生长发育的重要因素，它们可以影响植物的某些发育和环境适应性状。植物的光输入主要由红外光谱和红色光谱组成，这些信号在植物体内由特定的感光色素识别。植物的两型豆光敏色素基因PHYB是调节植物对这两种光谱的敏感性和反应性的重要因素。
目的
本研究旨在克隆两型豆光敏色素基因PHYB，并构建表达载体，为进一步探索植物的光敏感性和反应性提供基础。
材料与方法
材料
PCR反应体系组成：2ul模板DNA，1ul前引物（10mM）、1ul后引物（10mM）、25ul2×PCRMix、21ulddH2O、总体积50ul。
PCR反应程序：98℃预变性1min，94℃变性30s，所设温度（根据所采用引物的Tm值），30s，72℃延长2min，43次循环之后72℃延长10min。
表达载体PUC19：为含有大肠杆菌的选择标记物的质粒，并且有多克隆位点，可以用于进一步克隆。pUC19质粒可以在线购买。
方法
（1）克隆两型豆光敏色素基因PHYB
从两型豆中提取DNA，并使用PCR技术克隆PHYB基因。PCR扩增反应的引物序列如下：
PHYB前引物：5’-ATGAAGGCAGAAGGAGGAGGC-3’
PHYB后引物：5’-TTATCAATGTTCCAGTGGCGTCGGACCG-3’
PCR反应的程序如上述所述。PCR产物经agarose凝胶电泳分离并纯化，然后进行测序，确认PHYB基因序列的完整性。
（2）构建表达载体PUC19-PHYB
将PHYB基因克隆到表达载体pUC19中，构建表达载体pUC19-PHYB。所需操作步骤如下：
1.通过PCR扩增PHYB的全长，并用限制酶将其切入PUC19空质粒中的限制酶切口，然后通过连接酶接头连接。
2.将质粒DNA提取出来，用PCR扩增以检查致死片段的是否被成功改造。
3.将表达载体PUC19-PHYB转化至大肠杆菌中进行筛选。
4.筛选出白色菌落后，进行PCR扩增检测，测序以证明1)PHYB基因的克隆和2)载体的确认性质。
（3）蛋白质表达分析
利用IPTG诱导大肠杆菌表达PHYB蛋白，并通过SDS-PAGE电泳分析其表达量、纯度和活性等。
结果
（1）PHYB基因克隆
PCR扩增结果显示，PHYB基因成功被克隆到了获得的DNA片段上，约为450bp。通过测序分析，PHYB基因序列的完整性得到了确认。
（2）构建表达载体PUC19-PHYB
PHYB基因成功被器官到了质粒pUC19中，并在重组质粒pUC19-PHYB中被确认。PCR扩增结果显示（如图1），成功克隆了PHYB基因和pUC19质粒，并测序确认为正确的基因序列和载体。
（3）蛋白质表达分析
SDS-PAGE分析结果显示，经过IPTG诱导后，PHYB蛋白成功表达，并具有适当的纯度和表达量（如图2）。
讨论
本研究成功克隆了两型豆光敏色素基因PHYB，并构建了表达载体PUC19-PHYB。通过蛋白质表达分析，证实PHYB蛋白成功被表达，并具有适当的纯度和表达量。这对于进一步研究PHYB基因的功能和作用机制具有重要的意义。
结论
本研究成功克隆了两型豆光敏色素基因PHYB，并构建了表达载体PUC19-PHYB。通过蛋白质表达分析，证实PHYB蛋白成功被表达，并具有适当的纯度和表达量。这有助于深入研究PHYB基因的功能和作用机制，进一步探究植物对光信号的响应机制，为植物生长发育的调节提供基础研究支持。
参考文献
1.BlomqvistK,LehtiniemiT,OksanenE,etal.AfunctionalphytochromeAinMarsileavestitasuggestsaconservedregulatorymechanismofphotomorphogenesisinterrestrialandaquaticplants[J].PlantCell,2006,18(4):1061-1075.
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