紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建的综述报告.docx

紫花苜蓿光敏色素B基因片段克隆及RNA干扰表达载体的构建的综述报告
一、引言
紫花苜蓿（Medicagosativa）是全球广泛栽培的牧草和豆科作物，由于其优异的性状和高度的耐逆性，是生物燃料生产和草地生态系统修复的重要材料。然而，紫花苜蓿在夏季高温条件下容易发生光合作用损伤和叶片老化，进而影响其产量和品质。因此，进行紫花苜蓿的功能基因组学研究，针对其重要性状的调控机制进行解析具有重要意义。
对于根据性状筛选目标基因，开展RNA干扰研究可以实现对该基因的沉默，进而观察基因缺失后的生理、生化和形态等方面的变化，从而揭示该基因与生物性状之间的关系。首先需要进行基因克隆和表达载体构建，本文将介绍紫花苜蓿光敏色素B（PHYB）基因片段的克隆方法和RNA干扰表达载体的构建方法，以期提供研究该基因的参考方法。
二、紫花苜蓿PHYB基因片段的克隆方法
1.提取DNA：从紫花苜蓿幼苗的新鲜叶片中提取基因组DNA，可采用CTAB方法或商用基因组DNA提取试剂盒。
2.分离PCR重组酶：将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得目的片段后进行纯化和回收。
3.酶切：对PCR扩增得到的目的片段进行酶切操作，选取具有相应限制酶切位点的载体进行线性化处理。
4.连接：将目的基因片段与线性化载体按照同源重组的原理进行连接，利用带有限制酶切位点的连接试剂和连接酶进行反应，形成重组体。
5.克隆：将重组体转化到E.coli大肠杆菌中，筛选含有目的基因片段的克隆子，进行PCR和测序检测。
三、RNA干扰表达载体的构建方法
1.选取miR319d为RNA干扰探针：通过生物信息工具对PHYB基因进行分析，选择具有良好特异性的miR319d片段作为RNA干扰试剂探针。
2.序列合成：利用生物合成技术，合成带有miR319d片段、BamHI和EcoRI酶切位点的合成基因。
3.PCR扩增：采用合成基因作为模板，利用PCR扩增技术，扩增出具有miR319d片段的DNA片段。
4.酶切和连接：将PCR扩增的DNA片段用BamHI和EcoRI限制性酶进行酶切，与表达载体pCAMBIA2300分子进行连接，形成RNA干扰表达载体。
5.克隆和筛选：将RNA干扰表达载体转化到大肠杆菌中，筛选出含有RNA干扰探针的克隆子进行测序和酶切检测。
四、总结
本文介绍了紫花苜蓿PHYB基因片段的克隆方法和RNA干扰表达载体的构建方法，对于进行基因功能研究具有一定的参考意义。在后续的研究中，可将该RNA干扰表达载体进行植物转化，沉默光敏色素B基因，观察光合作用、叶片生长和发育等方面的变化，揭示PHYB基因在紫花苜蓿生长和发育等生命过程中的作用机制。