PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验.docx

PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验
PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验
摘要：本文研究了PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验。通过引物PCR扩增PCV2ORF2基因，将其克隆到质粒pAdTrack-CMV载体中，并转化到EscherichiacoliDH5α细胞中进行纯化和测序验证。随后将pAdTrack-CMV-ORF2质粒与质粒pAdEasy-1重组为重组腺病毒载体，并转染到293细胞中，制备出PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗。小鼠免疫实验结果表明，该疫苗可有效引发小鼠产生特异性抗体，具有较好的免疫效果。
关键词：PCV2ORF2基因；重组腺病毒；疫苗；小鼠免疫试验
一、引言
猪圆环病毒2（PCV2）是一种属于科瑞奇氏病毒科的单链DNA病毒，对猪的健康和养殖业产生了重大影响。PCV2感染可引起猪圆环病，表现为瘦肉、消瘦、呼吸急促、发热、腹泻等症状。目前，PCV2圆环病毒疫苗几乎已成为国内外养猪业必备的生物制品之一，对于预防和控制PCV2感染具有重要意义。
PCV2ORF2基因编码着圆环病毒的主要抗原，也是PCV2疫苗的重要组成部分之一。因此，PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的构建和研究对于PCV2圆环病毒的预防和控制具有重要意义。
二、材料与方法
2.1实验材料
PCV2ORF2基因序列；质粒pAdTrack-CMV、pAdEasy-1；大肠杆菌DH5α；293细胞株；小鼠。
2.2实验方法
2.2.1PCR扩增PCV2ORF2基因
使用引物PCR扩增PCV2ORF2基因，并采用酚/氯仿提取法获得PCR产物。PCR扩增条件如下：初始变性，95℃，5min；35个循环，94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；最终延伸，72℃，10min。
PCR扩增引物序列为：
ORF2-F:5'-ATGAGAAGCTTCTCCGAAGCAAAGGTGTAGCGTCC-3'
ORF2-R:5'-ATTGGGCCCTTACTGTGGGTAAGGAAAGTGTGTCG-3'
2.2.2克隆PCV2ORF2基因到质粒pAdTrack-CMV载体中
PCR产物与质粒pAdTrack-CMV载体进行PCR克隆，在克隆前后对PCR产物和载体进行限制酶酶切，进行酶切后，PCR产物和载体连接酶连接后，经过大肠杆菌DH5α中的转化、筛选、扩增、纯化、测序，得到正确的pAdTrack-CMV-ORF2质粒。
2.2.3重组腺病毒质粒构建
将pAdTrack-CMV-ORF2质粒与质粒pAdEasy-1重组为重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-ORF2-pAdEasy-1。将重组质粒导入DH5α菌中转化，在LB平板增菌，检测阳性菌落后，经过增菌、纯化、酶切、测序确认后，获取重组腺病毒载体。
2.2.4重组腺病毒疫苗制备
将pAdTrack-CMV-ORF2-pAdEasy-1载体转染到293细胞中，经过哺乳动物细胞培养和体外感染等步骤，制备出重组腺病毒疫苗。
2.2.5小鼠免疫试验
将10只小鼠随机分成两组，其中一组作为对照组，接种灭活PCV2疫苗，另一组接种PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗。初免时间为14天，复免时间为28天。免疫后2周，采集小鼠血清，通过ELISA法检测小鼠血清中的PCV2抗体水平。
三、结果
3.1PCV2ORF2基因扩增和克隆
使用PCR扩增酶将PCV2ORF2基因扩增成功，并通过限制酶酶切、连接酶连接成功克隆到pAdTrack-CMV载体中，经过筛选和测序验证，成功获得pAdTrack-CMV-ORF2质粒。
3.2重组腺病毒载体构建
将pAdTrack-CMV-ORF2质粒与pAdEasy-1质粒重组后，获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-ORF2-pAdEasy-1，检测其序列正确性，并将其转化到293细胞中，制备出PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗。
3.3小鼠免疫试验
与对照组相比，接种PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的小鼠血清中PCV2抗体水平明显升高，且差异有统计学意义（P<0.05），表现出该疫苗具有较好的免疫效果。
四、讨论
PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗的构建是利用基因重组技术将PCV2ORF2基因与腺病毒载体结合，研究表明该疫苗可以有效地诱导机体产生抗体，从而提高机体对PCV2圆环病的抵抗力。因此，PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗是一个具有很高应用价值和发展前景的疫苗种类。
本文通过PCR扩增、克隆、纯化、转染、筛查、酶切、测序等步骤，成功构建了PCV2ORF2基因重组腺病毒疫苗，并通过小鼠免疫试验证明该疫苗具有很好的免疫效果。虽然本文结果仅为初步实验成果，但该对研发PCV2圆环病毒疫苗具有参考价值。
五、结论
本文详细阐述了