S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106011087A(43)申请公布日2016.10.12(21)申请号201610622267.3A61K39/02(2006.01)(22)申请日2016.07.28A61P31/04(2006.01)A61P31/14(2006.01)(71)申请人天津农学院C12R1/93(2006.01)地址300384天津市西青区津静公路22号(72)发明人金天明张东超弓建芳高珂珂李小慧林静孟佳丽尚翠玲李昕(74)专利代理机构天津市鼎和专利商标代理有限公司12101代理人谢宇强(51)Int.Cl.C12N7/01(2006.01)C12N15/861(2006.01)A61K39/295(2006.01)A61K39/215(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表2页附图3页(54)发明名称S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用(57)摘要本发明公开了一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，从IBVH52株和MGS6株中分别扩增出S1基因和TM-1基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC315-MCS-EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有S1基因和TM-1基因的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP；本发明用于免疫鸡以预防鸡传染性支气管炎和慢性呼吸道病，将此重组腺病毒免疫鸡后，鸡的抗体水平得到显著提高，且对鸡产生有效的保护作用。CN106011087ACN106011087A权利要求书1/1页1.一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)从IBVH52株和MGS6株中分别扩增出S1基因序列GI：EU817497.1和TM-1基因序列GI：S65869.1；所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：以S1-FSEQIDNO.1和S1-RSEQIDNO.2为引物，以IBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1基因；以TM-1-FSEQIDNO.3和TM-1-RSEQIDNO.4为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；2)分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP；3)将重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP。2.如权利要求1所述的S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。3.如权利要求1所述的S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防鸡传染性支气管炎和鸡慢性呼吸道病中的应用。2CN106011087A说明书1/8页S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用技术领域[0001]本发明属于基因生物工程领域，涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用IBVS1基因和MGTM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。背景技术[0002]鸡传染性支气管炎(Avianinfectiousbronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性、传染性呼吸道疾病，是世界禽类的主要呼吸道传染性疾病之一。鸡慢性呼吸道病(Chronicrespiratorydisease,CRD)是由鸡毒支原体(MycoplasmaGallisepticum,MG)感染引起的接触性、慢性呼吸道传染病。CRD主要引起产蛋鸡产蛋量下降，蛋的品质降低，饲料转化率降低，常给养鸡业带来巨大的经济损失。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可以预防和控制上述两种疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。发明内容[0003]本发明所要解决的技术问题是，提供一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，将IBV的主要的免疫保护性基因(S1基因)和MG的膜外蛋白基因(TM-1基因)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒，分别检测免疫鸡后机体内产生的两种抗体水平，通过免疫攻毒保护试验检测其免疫保护效果，评价研制的预防IB和CRD的二联基因工程活载体