LASP-1在HBX促肝癌细胞增殖和迁移中作用的研究.docx

LASP-1在HBX促肝癌细胞增殖和迁移中作用的研究
摘要
肝癌是全球最常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率均居高不下。HBX是肝炎病毒B的表面抗原中一个非结构蛋白，已经被证实和肝癌的发展密切相关。此外，最近的研究表明，LASP-1在肝癌中的表达及其活性也与肝癌的发展有一定关联。本研究旨在探究LASP-1与HBX之间的相互作用，并进一步明确其在HBX促进肝癌细胞增殖和迁移中的作用。
通过病例对比研究，我们发现肝癌组织中LASP-1的表达水平明显高于正常组织。同时，PCR实验和免疫印迹检测结果表明，HBX蛋白的表达也会促使LASP-1的表达和激活。
在人类肝癌细胞株HepG2中进一步实验，我们发现过表达LASP-1可促进HBX对肝癌细胞的增殖和迁移作用。此外，我们进一步探索了HBX/LASP-1途径对于肝癌细胞中EGFR和PI3K/Akt等关键信号通路的影响，发现过表达LASP-1可促进HBX抑制PTEN的功能，同时促进EGFR的激活，并增强PI3K/Akt通路的活性。因此，我们认为LASP-1在HBX促进肝癌细胞增殖和迁移中发挥着至关重要的作用。这些结果可能有助于进一步深入探究肝癌治疗的新途径。
关键词：LASP-1，HBX，肝癌，增殖，迁移
Introduction
肝癌是全球最常见的肿瘤之一，也是导致癌症死亡的主要原因之一。其高度致死性和难以治愈性使其成为一个导致全球公众卫生问题的重要因素。肝癌的病因及发展机制十分复杂，而病因之一的乙肝病毒不仅可通过直接损伤细胞、干扰信号通路等方式导致肝癌的发展，还通过其他机制与肝癌的发展密切相关。
在肝炎病毒B的表面抗原（HBsAg）的非结构蛋白中，HBX蛋白是一个引人注目的功能蛋白。已经有大量的研究显示，HBX蛋白参与了肝细胞增殖、细胞周期调节以及凋亡等重要的信号通路。然而，HBX对肝癌细胞增殖和迁移等关键生物学过程的调控机制尚不清楚。
最近，一些研究表明，LIM和SH3蛋白-1（LASP-1）在肝癌发展过程中的表达和活性也与肝癌的发展相关。LASP-1是一种富含第4个LIM结构域和一个SH3区域的蛋白质，它作为肿瘤的关键靶点已经得到了广泛的研究。
本研究旨在探究LASP-1与HBX之间的相互作用，并进一步明确其在HBX促进肝癌细胞增殖和迁移中的作用。通过实验探讨肝癌细胞株HepG2中LASP-1和HBX的表达、激活及功能的关系，探讨LASP-1在HBX促进肝癌细胞增殖和迁移中的作用，为深入研究肝癌的发展机制提供新思路。
Materialsandmethods
1.细胞培养
人类肝癌细胞株HepG2及正常肝细胞L02由中国科学院大学生物学研究所提供。培养基为DMEM（高糖）supplemented10％FBS，100U/mLofpenicillinand100mg/mLofstreptomycin。细胞培养在37°C、5%CO2中进行。
2.实验药物
RecombinantHBXproteinswereexpressedinE.coliandpurifiedbyHis-tagaffinitychromatographyaspreviouslydescribed(Suetal.,2015).Recombinantplasmidsencodingmyc-taggedLASP-1werepurchasedfromInvitrogen.
3.PCR实验
通过多聚酶链式反应（PCR）分析LASP-1和HBX基因表达水平。及反转录成cDNA，PCR反应体系包含2μLcDNA，1μL约200nmol/L的引物，7μLH20及10μL2倍PCRMix。用以下引物：LASP-1，Forward5’-GCGCTCCTGAGAAAGAACCT-3’,Reverse5’-CGCATGGTTCACTGCAGT-3’；HBXForward5’-GGTTTCCCATGCATGGAACC-3’，Reverse5’-AAAAAGGATCCTCACTTC-3’。
4.免疫印迹实验
通过免疫印迹分析LASP-1、HBX同源表达。25μg蛋白质经SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜上，随后在室温下阻断1h，并在4℃下过夜孵育，及primay抗体包括LASP-1（1:1000）和HBX（1:500）适当稀释的蛋白。次抗体包括兔IgG或羊IgG（1:10000）的碱性磷酸酶共价耦合产物。最终的检测结果通过ECLreagentKit(Millipore)进行显影观察。
5.过表达实验
将LASP-1的编码序列插入质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，转化至HepG2过表达LASP-1。一个未插入LASP-1的质粒被作为对照实验。
6.免疫荧光染色
免疫荧光染色可用于LASP-1和HBX在细胞内的定位分析。经过培养后，H