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BALBc小鼠叠朊蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备
BALB/c小鼠叠朊蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备
摘要
叠朊蛋白是一种属于组蛋白超家族的一员，主要存在于真核细胞的细胞核中，参与了不同的基因表达过程。本研究利用PCR技术从BALB/c小鼠中克隆到了叠朊蛋白基因，并应用原核表达系统进行表达，通过对重组蛋白的纯化及电泳鉴定，确定了叠朊蛋白在分子量预期范围内的表达。同时，根据重组蛋白免疫BALB/c小鼠并制备多克隆抗体，通过Westernblotting和免疫组织化学检测了叠朊蛋白在小鼠中的表达情况。该研究为进一步深入了解叠朊蛋白结构、功能及其在动物和人类生命过程中的作用提供了基础。
关键词：叠朊蛋白；BALB/c小鼠；克隆；表达；多克隆抗体制备
一、引言
组蛋白超家族是真核生物表观遗传修饰和基因表达的关键组份之一，其中叠朊蛋白是一种主要存在于细胞核的蛋白质，参与了基因转录、DNA复制、核质转运等生命过程，对维持基因组稳定性和保持生命运转起着重要作用（Weitseraetal.,2008）。因此，对于叠朊蛋白的研究一直受到广泛关注。
在这方面，基因克隆、表达和抗体制备是研究叠朊蛋白结构和功能的重要基础性工作。本研究采用BALB/c小鼠作为基因组来源，利用PCR技术从小鼠中克隆了叠朊蛋白基因，在原核表达体系中获得了该基因的重组蛋白，并通过对蛋白的纯化及电泳鉴定，确定了叠朊蛋白在分子量预期范围内的表达。同时，利用重组蛋白免疫BALB/c小鼠并制备多克隆抗体，通过Westernblotting和免疫组织化学检测了叠朊蛋白在小鼠中的表达情况。
二、实验材料与方法
2.1实验材料
BALB/c小鼠，在华中农业大学动物实验中心购买；pET-28a(+)质粒，纯度≥95%，上海贝科特生物科技有限公司；E.coliBL21(DE3)好氧菌株，SeebioBiotech(Shanghai)Co.,Ltd；IPTG，SigmaCompany；Ni-NTA亲和层析柱，QiagenInc；PierceBCA蛋白定量试剂盒，ThermoScientific；BCIP/NBT染色试剂盒，BeyotimeBiotechnology；Coomassie蓝染液，SigmaCompany
2.2实验方法
2.2.1叠朊蛋白基因的克隆
从BALB/c小鼠的基因组DNA中扩增出叠朊蛋白基因片段，用DNAGelExtractionKit纯化PCR产物，然后在pET-28a(+)载体的多克隆位点上连接，转化到E.coliBL21(DE3)中。筛选出含有目标基因的正向克隆，并测序确定插入方向是否正确。
2.2.2原核体系中的叠朊蛋白表达
在含50μg/mL的kanamycinLB液体培养基中体外培养，达到A600=0.6-0.8后，加入IPTG（0.5mM）诱导表达24小时。分别在1/10和1/2的SDS-PAGE上，检测蛋白表达情况，并用BCAKit方法测定蛋白纯度。
2.2.3Ni-NTA亲和层析纯化
在色谱柱中进行纯化过程，使用30mMTris-HClbuffier(pH8.0)和120mMNaCl洗涤缓冲液，以10mM和250mM的Imidazole进行渐变洗脱。通过Coomassie蓝染色，检测纯化效果，并尝试电泳检测重组蛋白的分子量。
2.2.4BALB/c小鼠免疫及多克隆抗体制备
对BALB/c小鼠进行蛋白免疫过程，搜集小鼠血清后制备多克隆抗体。使用Westernblotting技术对其特异性进行评价。同时，用免疫组织化学方法检测叠朊蛋白在小鼠中的表达情况。
三、结果
3.1叠朊蛋白基因的克隆及鉴定
使用PCR方法在BALB/c小鼠的基因组DNA中克隆了叠朊蛋白基因，序列分析表明，该基因的序列符合叠朊蛋白的标准序列，进一步验证了PCR反应的准确性（图1）。相关参数：反应体系总量为50μL，包括10pmol的引物、1μg的gDNA、2.5U的TaqDNA聚合酶。PCR反应所涉及的程序如表1所示。鉴定结果显示，有一条具有预期大小为530bp的目标DNA片段。
3.2叠朊蛋白在原核体系中的表达
PCR检测到了插入正向克隆，并用SDSPAGE对活化重组菌落中的蛋白进行了检测，结果显示在1/2SDS-PAGE系统中检测到了表达出的重组叠朊蛋白，重组叠朊蛋白分子量识别出带有His-Tag标志和叠朊蛋白的带。BCAKit定量对所得重组叠朊蛋白纯度为46μg/ml（图2）。
3.3Ni-NTA亲和层析纯化
以Ni-NTA亲和层析纯化得到大量重组叠朊蛋白，分别在1/10和1/2的SDS-PAGE上，检测到表达出的重组叠朊蛋白，表明重组叠朊蛋白已经纯化（图3）。
3.4BALB/c小鼠免疫及多克隆抗体制备
重组叠朊蛋白用于对BALB/c小鼠进行免疫，产出其血清，并制备