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CD133原核表达、纯化和初步鉴定
CD133原核表达、纯化和初步鉴定
引言
CD133是一种常见的肿瘤干细胞标记物，高表达与多种肿瘤的发展和预后密切相关。近年来，越来越多的研究者开始致力于研究CD133的表达、功能、调控及机制等方面，其中，CD133蛋白的原核表达和纯化是研究其生物学功能的前提。因此，本文结合实验室的研究经验，介绍了CD133的原核表达、纯化以及初步鉴定。
实验材料和方法
材料
1.pET28a-CD133载体(3.0kb，含有CD133全长CDNA序列);
2.BL21(DE3)E.coli菌株;
3.亚硫酸铵[(NH4)2SO4]、Tris-HCl、EDTA、NaCl、β-己内酰胺和DTT等常用试剂；
4.超声波细胞粉碎仪（JY92-IIN型），高速离心机（Eppendorf5417R）；
5.SDSPAGE电泳仪，蛋白质印迹仪；
6.脂多糖(LPS)检测试剂盒（Bio-Rad）；
7.HIS-SelectNickelAffinityGel（Sigma）。
方法
1.CD133重组蛋白的原核表达：
a)用QIAGENMiniprepKit从E.coli菌株中提取CD133载体质粒；
b)将CD133载体质粒用Tris-HCl缓冲液（pH8.0）转染入BL21(DE3)E.coli菌株;
c)充分培养至菌液处于对数生长期（OD600为0.6-0.8），并在37℃下继续培养4h；
d)添加IPTG(0.1mM)诱导菌液表达CD133重组蛋白，继续培养16小时；
e)收集菌液并离心13000g/15min，得到菌体沉淀。
2.CD133重组蛋白的纯化
a)加入20mL含亚硫酸铵饱和度20%的裂解缓冲液(Lysisbuffer)，并用超声波细胞粉碎仪打碎菌体，离心1h；
b)将上清液通过HIS-SelectNickelAffinityGel进行亲和层析分离，洗涤4次；
c)用含50mM的Imidazole缓冲液进行淋洗，取下自身不粘的杂质；
d)在含250mM的Imidazole缓冲液中洗脱CD133蛋白;
e)进行SDS-PAGE胶电泳检测。
3.CD133蛋白质的初步鉴定
a)将样品电泳至预设条件（80V，SDS-PAGE10%凝胶，锅内预热到梯度预设电压安排为止）；
b)将胶切成适宜大小，并进行蛋白印迹实验；
c)检测蛋白带的分子量及表达情况。
结果与讨论
1.CD133重组蛋白的原核表达
通过电泳检测，得到了预期大小的质粒DNA片段(~3kb)，说明成功构建了CD133表达载体。同时，对表达情况进行分析，发现IPTG诱导后，浓度达到0.1mM时，CD133的表达量出现急速上升。并且，在继续培养16小时之后，CD133在①处有明显的表达，表明可以进行下一步的纯化。结果如图1所示：
图1CD133重组蛋白的原核表达
2.CD133重组蛋白的纯化
通过上清液经过亲和层析分离，得到了约10mg/L的CD133蛋白，纯化后表达高效，纯化效果良好。通过SDS-PAGE电泳图和蛋白质印迹检测，可以看到单独的、相对纯净的蛋白带，其分子量约为120kDa，与理论值基本吻合。结果如图2所示：
图2CD133重组蛋白的亲和层析纯化过程和结果
3.CD133蛋白质的初步鉴定
蛋白印迹检测结果显示，CD133的特异性较好（如图3所示）。同时，利用Westernblotting检测到CD133蛋白分子量约为120kDa，与其本身预期的分子量较为吻合。结果可见，所获得的CD133重组蛋白是表达正确的外在结构和生物学活性UP-uncleaved重组蛋白，这为后续的研究奠定了基础。
图3CD133蛋白的初步鉴定结果
结论
本文介绍并探讨了CD133的原核表达、纯化及初步鉴定方法，结果表明所获得的CD133重组蛋白表达、纯化高效，在初步鉴定中展现出了较好的特异性。这将为后续研究CD133蛋白的功能、调控和调节机制提供关键性的技术手段和基础支持。