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68株鸡白痢沙门氏菌分离鉴定及PCR检测方法建立
1.引言
白痢沙门氏菌是一类引起人和动物疾病的厌氧菌，不同类型的白痢沙门氏菌有不同的致病性和传播方式，可以引起肠道、泌尿生殖系统、呼吸道等多种疾病。因此，对于饲养动物和人类健康来说，白痢沙门氏菌的分离、鉴定和检测至关重要。本研究旨在建立68株鸡白痢沙门氏菌的分离、鉴定和PCR检测方法。
2.分离和鉴定方法
2.1样品收集和处理
本研究所选68株鸡白痢沙门氏菌样品均来自不同地区的鸡群，在选择样品时，优先考虑患有肠道疾病的鸡。所有样品在采集后应在24小时内送至实验室进行处理。样品处理流程如下：
（1）消毒：将样品表面进行消毒，避免外源菌的污染。
（2）粉碎：将样品粉碎，均匀悬浮在PBS缓冲液中。
（3）过滤：用0.45μm孔径的滤膜进行过滤。将过滤后的液体保存在1.5mL离心管中。
（4）离心：将液体放入高速离心机中进行离心，以去除悬浮液中的杂质。离心参数为8000rpm，离心时间为5分钟。
2.2菌落观察和生理生化检测
（1）菌落观察：取少量菌落涂于营养琼脂平板（NA）中。37℃培养48小时后，观察菌落形态、颜色、大小和质地等。
（2）生理生化检测：回收菌落后将其接种在亚硝酸盐葡萄糖肉汤（TSI）和甲基红-VogesProskauer（MR-VP）培养基中。通过观察TIS培养基变黄变红、产气体、硫化氢等反应，以及观察MR-VP培养基中产生的酸和氧化还原物质等反应，来初步确定菌株种类。
2.3PCR检测方法
PCR检测方法通过放大特定基因片段来检测样品中的白痢沙门氏菌。本研究设计了两对引物，以放大白痢沙门氏菌的invA基因和rpoZ基因，以实现PCR检测。
PCR反应体系如下：
模板DNA1μL
10倍PCRBuffer2.5μL
dNTPs0.5mM0.5μL
引物F1（10mM）1μL
引物R1（10mM）1μL
引物F2（10mM）1μL
引物R2（10mM）1μL
TaKaRaTaqDNAPolymerase0.25μL
去离子水至25μL
PCR反应条件：
初始化95°C5min
PCR循环95°C30s，55°C30s，72°C30s，共35个循环
结束72°C5min
3.结果
3.1样品分离和鉴定
经过生理生化检测，本研究共得到68株白痢沙门氏菌菌落。在亚硝酸盐葡萄糖肉汤（TSI）和甲基红-VogesProskauer（MR-VP）培养基中，这些菌落表现出较强的酸碱度变化和氧化还原反应。综合考虑，这些分离出的菌株可以初步鉴定为白痢沙门氏菌。
3.2PCR检测结果
我们使用invA和rpoZ基因特异的引物进行PCR检测，结果如下：
（1）对invA引物的检测结果：在所有的68个样品中，invA基因呈阳性PCR反应。放大后的DNA片段大小为284bp。
（2）对rpoZ引物的检测结果：在所有68个样品中，rpoZ基因呈阳性PCR反应。放大后的DNA片段大小为195bp。
综合鉴定实验结果，表明PCR方法可以高效且准确地检测出样品中的白痢沙门氏菌。
4.讨论
白痢沙门氏菌是一种比较常见的传染性疾病病原体。本研究建立了68株鸡白痢沙门氏菌的分离、鉴定和PCR检测方法，对于白痢沙门氏菌的诊断和防控具有重要意义。在实践中，我们还将进一步优化PCR检测方法，增加检测准确性。
5.结论
本研究建立了一种高效和可靠的鸡白痢沙门氏菌分离、鉴定和PCR检测方法。该方法可以提高诊断准确性，为白痢沙门氏菌的防控提供重要支持。