DNA分子遗传标记在中药中的应用.pptx

会计学DNA分子(fēnzǐ)遗传标记三、基于PCR的分子(fēnzǐ)标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。
随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）2、DNA扩增产物指纹分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（5～8个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3、特征扩增区段(qūduàn)测序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。RFLP技术(jìshù)及其应用基本原理RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)/DNA多态性根据(gēnjù)其产生的两种基本方式/RFLP与镰状细胞(xìbāo)贫血基本(jīběn)实验步骤RFLP的优点(yōudiǎn)及局限性RFLP用于亲缘关系(guānxì)分析RFLP在中药材鉴别(jiànbié)中的应用RAPD技术(jìshù)及其应用RAPD技术(jìshù)基本原理RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA基本(jīběn)实验步骤RAPD分析(fēnxī)的优越性和不足不足：
（1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36℃),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复；
（2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高；
（3）由于存在共迁移，分子量相同(xiānɡtónɡ)的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物；
（4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。M12345678910111213141516
123456789101112M
M12345678910111213M123456CK789101112图4不同(bùtónɡ)复性温度对RAPD带型的影响
Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperatureRAPD分析在中药研究(yánjiū)中的应用AFLP技术(jìshù)及其应用AFLP基本原理基本(jīběn)实验步骤AFLP的实验(shíyàn)过程AFLP反应流程：
AFLP反应程序主要包括模板(múbǎn)DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：
首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。
酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。
DNA片段的预扩增。
在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。
PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。
多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。为什么用双酶解?为什么要预扩增?/AFLPs/荧光(yíngguāng)标记全自动AFLPAFLP技术(jìshù)特点AFLP的重复性问题(wèntí)AFLP在分子中药(zhōngyào)中的应用微卫星标记(biāojì)分析（SSR）SSR位点标记(biāojì)的优点SSR位点标记(biāojì)的缺点SSR标记(biāojì)的应用领域Comparisonamonggeneticmarkers由微卫星衍生(yǎnshēnɡ)的微卫星标记ISSR(Intersimplesequencerepeat)这是Zietkiewitcz等(1994)发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记。
与SSR标记相反，该法是直接利用同位素标记的SSR序列为引物，用PCR的方法扩增两个SSR之间的单拷贝序列。
为增加特异性，设计引物时在引物的5′端和3′端分别引入1～2个选择性碱基，引物长度16～18bp，扩增产物通过放射自显影显现，这样其扩增物就是MP-PCR扩增产物中的一部分，提高了实验结果的可重复性。
ISSR引物的开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列，开发费用(fèiyong)降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不象SSR标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR