DNA分子遗传标记在中药中的应用课件.ppt

DNA分子遗传标记三、基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）2、DNA扩增产物指纹分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（5～8个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、特征扩增区段测序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。RFLP技术及其应用基本原理RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)DNA多态性根据其产生的两种基本方式RFLP与镰状细胞贫血基本实验步骤RFLP的优点及局限性RFLP用于亲缘关系分析RFLP在中药材鉴别中的应用RAPD技术及其应用RAPD技术基本原理RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA基本实验步骤RAPD分析的优越性和不足不足：（1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36℃),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复；（2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高；（3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物；（4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。M12345678910111213141516123456789101112MM12345678910111213M123456CK789101112图4不同复性温度对RAPD带型的影响Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperatureRAPD分析在中药研究中的应用AFLP技术及其应用AFLP基本原理基本实验步骤AFLP的实验过程AFLP反应流程：AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。DNA片段的预扩增。在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。为什么用双酶解?为什么要预扩增?AFLPs荧光标记全自动AFLPAFLP技术特点AFLP的重复性问题AFLP在分子中药中的应用微卫星标记分析（SSR）SSR位点标记的优点SSR位点标记的缺点SSR标记的应用领域Comparisonamonggeneticmarkers由微卫星衍生的微卫星标记ISSR(Intersimplesequencerepeat)这是Zietkiewitcz等(1994)发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记。与SSR标记相反，该法是直接利用同位素标记的SSR序列为引物，用PCR的方法扩增两个SSR之间的单拷贝序列。为增加特异性，设计引物时在引物的5′端和3′端分别引入1～2个选择性碱基，引物长度16～18bp，扩增产物通过放射自显影显现，这样其扩增物就是MP-PCR扩增产物中的一部分，提高了实验结果的可重复性。ISSR引物的开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不象SSR标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记，已用于遗传作图、品种鉴定等研究。DNA测序技术及其应用在中药研究中用于测序的基因DNA分子遗传标记在中药鉴定中的应用采用RAPD分子标记方法比较4种甘草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、刺甘草和刺果甘草的遗传关系。通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析，结果发现富含甘草甜素的光果甘草和乌拉尔甘草之间遗传关系非常相近。这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。2．在中药材鉴