外源基因的表达.pptx

会计学目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自(gèzì)的特点。
在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。
在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。6.1基因(jīyīn)表达的机制的延伸(yánshēn)与稳定外源基因mRNA的有效(yǒuxiào)翻译不同(bùtónɡ)基因组使用密码子具有选择性。表达蛋白(dànbái)在细胞中的稳定性目的基因(jīyīn)沉默6.2基因(jīyīn)表达的调控元件原核(yuánhé)生物的启动子真核生物(shēngwù)的启动子Ⅰ型启动子Ⅱ型启动子Ⅲ型启动子启动子与转录(zhuǎnlù)启动/sfactor:启动子的分离(fēnlí)增强子终止子①本征终止子②依赖型终止子在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5’ 3’方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3’－OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录(zhuǎnlù)过程。终止过程需要消耗能量，所以，ρ因子有终止转录(zhuǎnlù)和核苷三磷酸酶两种功能。衰减(shuāijiǎn)子LowTrp/绝缘子反义子(yìzǐ)复制(fùzhì)水平的调节翻译(fānyì)水平的调节6.3外源基因表达(biǎodá)系统原核生物(shēngwù)作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)基因表达系统大肠杆菌基因表达(biǎodá)载体大肠杆菌基因(jīyīn)表达载体可分为3个系统：（1）DNA复制及重组载体(zàitǐ)的选择系统选择(xuǎnzé)标记大肠杆菌表达载体(zàitǐ)上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体(zàitǐ)上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体(zàitǐ)的宿主，同时保证载体(zàitǐ)在宿主中的稳定存在。在构建大肠杆菌表达载体(zàitǐ)的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。（2）外源目的基因(jīyīn)的转录系统启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。
启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用位点的特异性和种属特异性等特征。
在大肠杆菌细胞中大多数基因的启动子与转录起始位点间的距离为6～9bp，但对于(duìyú)要表达的外源基因来说，启动子与转录起始位点的最佳距离还有待实验来确定。抑制(yìzhì)物基因转录(zhuǎnlù)终止子（3）蛋白质的翻译(fānyì)系统核糖体结合(jiéhé)位点SD序列与起始密码子之间的距离对保证准确和高效翻译也很重要。SD序列与起始密码子之间的距离一般为6～8bp，多数情况下为7bp，此间的碱基多一个或少一个都会影响翻译的起始效率。
SD序列与起始密码子之间的碱基组成也影响翻译的起始效率。研究表明，SD序列后面的碱基为AAAA或UUUU时，翻译的起始效率最高，而当序列为CCCC或GGGG时，翻译的起始效率分别为最高值的50％和25％。
有的载体的启动子后接有SD序列，而另一些载体的启动子后没有接SD序列，那么则需要目的基因上游带进SD序列。
若在大肠杆菌中表达真核基因或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因，则必须从外部(wàibù)同时提供启动子和有效的核糖体结位点。翻译(fānyì)起始密码子在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列(xùliè)UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。宿主(sùzhǔ)菌常见的大肠杆菌表达(biǎodá)系统外源基因(jīyīn)在大肠杆菌表达的形式包涵(bāohɑn)体的组成融合(rónghé)蛋白寡聚型外源蛋白(dànbái)整合型外源蛋白(dànbái)分泌(fēnmì)型外源蛋白②分泌到细胞(xìbāo)外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞(xìbāo)内蛋白酶所降解。
③简化了发酵后处理的纯化工艺。在大肠杆菌中高效表达(biǎodá)目的基因的策略芽孢杆菌(gǎnjūn)表达系统芽孢杆菌(gǎnjūn)表达载体启动子宿主