外源基因表达与基因工程药物.ppt

第十章

外源基因表达与基因工程药物
DNARecombinationTechnologyDNA克隆、测序与重组技术的历史重组DNA技术的发展史重组DNA技术一、重组DNA技术相关概念技术水平：分子克隆(molecularclone)
（即DNA克隆）
细胞克隆
个体克隆（动物或植物）应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等（二）工具酶重组DNA技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶
(restrictionendonuclease)与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；
第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)BamHⅠ来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。名称识别序列及切割位点二、DNA连接酶
三、DNA聚合酶

四、修饰酶

1、末端转移酶
2、碱性磷酸酶
3、T4多核苷酸激酶
4、DNA甲基化酶目的基因(targetgene)基因载体克隆载体(cloningvector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。载体的选择标准可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒(plasmid)质粒载体分类pBR322载体特点pUC系列载体特点λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）粘性质粒(cosmid)
粘性质粒

也称柯斯载体。是带有粘性末端位
点的质粒,柯斯质粒是人工建造的的含有
λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊
类型的质粒载体。

粘性质粒粘性质粒酵母人工染色体
(yeastartificialchromosome,YAC)
细菌人工染色体
(bacterialartificialchromosome,BAC)
动物病毒DNA改造的载体
（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）重组DNA技术基本原理以
质
粒
为
载
体
的
DNA
克
隆
过
程（一）目的基因的获取化学合成法获取目的基因组织或细胞染色体DNAmRNA（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接BamHⅠ切割反应不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接平端连接目的基因在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5´
3´由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用受体菌条件：
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent)转化作用例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。转导作用常用转化方法1.直接选择法
(1)抗药性标记选择
(2)标志补救(markerrescue)
(3)分子杂交法
原位杂交
Southern印迹
2.免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法)
抗药性标记选择α互补原位杂交Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出重组DNA技术操作过程可形象归纳为：重组DNA技术操作的主要步骤第四节表达体系的建立：
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离纯化标准：选择标志 强启动子
翻译调控序列 多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足：
1、不宜表达真核基因组DNA；
2、不能加工表达的真核蛋白质；
3、表达的蛋白质常形成不溶性包涵体
4、很难表达大量可溶性蛋白。大鼠胰岛素原cDNA
的表达和分泌 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA
可适当修饰表达的蛋白质
表达产物分区域积累
缺点：操作技术难、费时、经济表达载体pFASTBACI的物理图谱表达载体YEpIPT的物理图谱第五节

DNA重组技术在医学中的应用

一、重组DNA技术的应用二、疾病基因的发现与克隆三、生物制药重组DNA医药产品基因诊断(geneticdiagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断。基本过程：能正确扩增靶基因；
能准确区