弓形虫TR基因与ROP18基因缺失株的构建及其生物学功能研究的任务书.docx

弓形虫TR基因与ROP18基因缺失株的构建及其生物学功能研究的任务书
任务书
一、研究背景
弓形虫是一种重要的人畜共患病原微生物，可引起弓形虫病，对人类、畜禽健康和相关产业造成极大损失。TR家族与ROP家族基因是弓形虫中的两个重要家族基因，TR是Rh家族的一员，而ROP则是Rhoptry家族的一员。TR基因家族中共包含有9个成员基因，它们的编码产物均为膜蛋白。TR基因家族广泛存在于原生动物中，但是不同属的TR基因序列和结构之间具有较大的差异性。ROP家族由大约50个基因组成，编码产物是一种前体蛋白，能够在侵染宿主细胞时在锥体形成囊泡释放出来，同时将泡壳融合到宿主细胞膜上，因此ROP家族在弓形虫寄生侵染进程中起着非常重要的作用。
很多研究表明，TR基因和ROP基因对于弓形虫的寄生侵染的生物学功能至关重要。其中TRAP基因是TR基因家族中最为重要的一个成员。TRAP基因缺失株的研究表明，TRAP基因对于弓形虫寄生侵染过程中的粘附和侵入宿主细胞起着至关重要的作用。ROP18基因是ROP家族中非常关键的一个基因，它能够在侵染宿主细胞时调控宿主细胞胞内微环境，从而影响宿主细胞的生理代谢功能。ROP18的缺失会导致弓形虫在肝、肺和脑等组织中遭遇免疫反应时发生巨噬细胞识别和杀伤。但是，在弓形虫寄生侵染的研究中，TR基因和ROP基因之间的相互作用机制还没有被充分阐明。
二、研究目的
本研究旨在构建TR基因和ROP18基因缺失的弓形虫株，从而揭示TR基因和ROP18基因之间的相互作用机制以及生物学功能。通过对缺失TR基因和ROP18基因后弓形虫菌株的生长与存活率的比较，以及在宿主细胞中的侵染能力的检测，探讨TR基因和ROP18基因的相互作用对弓形虫的侵染和生长起到的作用。
三、研究内容
1.构建TR基因及ROP18基因缺失的弓形虫株，利用靶向基因敲除策略构建TR和ROP18基因敲除株菌株。
2.分析TR和ROP18基因敲除株菌株的表型特征，比较缺失TR和ROP18基因后的弓形虫株与野生型株菌株在生长和存活率上的差异。
3.检测缺失TR和ROP18基因后的弓形虫株在宿主细胞中的侵染能力，通过活体显微镜下的观察和控制性实验来证明TR和ROP18基因对弓形虫侵染能力的影响。
4.通过比较法、生化分析等手段，阐明TR和ROP18基因的缺失对弓形虫寄生侵染过程中的相互作用机制和生物学功能的影响。
四、研究方法与技术路线
1.构建TR基因及ROP18基因缺失的弓形虫株。利用CRISPR-Cas9技术，选择适当的序列作为靶向序列，设计CRISPR引物，并构建敲除载体，通过电转化或刮刀法等方法将敲除载体送入细胞内，经筛选提取具有敲除TR和ROP18的基因的克隆菌株。
2.分析TR和ROP18基因敲除株菌株的表型特征。通过菌落形态、倍增时间等方式分析缺失TR和ROP18基因后的弓形虫株的表型特征与比较。
3.检测缺失TR和ROP18基因后的弓形虫株在宿主细胞中的侵染能力。通过体外培养宿主细胞、活体显微镜或荧光染色等方法来观察和记录弓形虫缺失TR和ROP18基因后的寄生侵染能力。
4.阐明TR和ROP18基因的缺失对弓形虫寄生侵染过程中的相互作用机制和生物学功能的影响。通过比较法、生化分析等手段，准确描述TR和ROP18基因缺失对弓形虫寄生侵染过程中的相互作用机制和生物学功能的影响。
五、预期结果与意义
本研究将通过构建TR基因和ROP18基因缺失的弓形虫，揭示TR基因和ROP18基因之间的相互作用机制以及生物学功能，阐明了TR基因和ROP18基因在弓形虫寄生侵染过程中的作用，为弓形虫防治以及相关疾病的药物研发提供理论依据和实践指导，具有重要的理论和应用价值。