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棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基基因克隆及功能研究任务书 任务书 一、任务背景 棉铃虫是棉花的主要害虫之一,对棉花的危害严重,可能导致棉花产量大幅减少。为了控制棉铃虫数量,传统的防治措施包括化学除虫剂和生物防治等,但这些方法都有一定的局限性。因此,探索新的防治方法至关重要。 烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基是一种神经递质受体的蛋白质分子,它可被烟碱类化合物如尼古丁和烟碱酸结合,从而发挥调节神经递质传递的作用。最近的研究表明,通过阻断棉铃虫体内的烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基的功能,可以有效降低棉铃虫的数量。因此,基于烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基作为靶点的防治方法具有很好的应用前景。 但是,目前有关棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基的研究还非常有限,这给研究该受体的功能机制和其作为防治棉铃虫的靶点带来了挑战。因此,本研究旨在克隆棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基基因,进一步研究其功能和生物学意义。 二、任务目标 本研究的主要目标包括以下几个方面: 1.克隆棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基基因。 2.分析该基因的序列特征、结构和进化关系。 3.构建烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基的原核表达系统,获取可溶性蛋白表达。 4.实现棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基的原核表达和纯化。 5.研究烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基与烟碱类化合物的结合关系。 6.探究棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基在神经传递调节中的作用机制。 三、研究方法 1.基因克隆 通过组织特异性的转录本资料库,利用PCR技术设计特异性引物,对棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基基因进行克隆。克隆后的基因会进行序列分析和比对。 2.基因结构和进化关系的分析 通过多序列比对和整合获得的序列,对其进行相应基本元件的序列和结构预测,如起始密码子、终止密码子、剪切位点、跨膜区域、亚基结构域等。同时,进行网站homologene软件工具分析,从而预测其进化关系。 3.原核表达系统 根据总插入长度设计并合成适当的引物,从棉铃虫采集的幼虫中提取总RNA,用RT-PCR进行扩增,克隆到原核表达载体中,并用PCR验证。将表达载体转化到适当宿主菌中,获得表达蛋白。 4.纯化蛋白 通过离心分离,纯化可溶性的蛋白,进行离子交换层析和亲和层析的分离纯化,最终得到单一蛋白的样品。 5.结合实验 采用affinitypull-down实验,探究烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基与烟碱类化合物的结合情况。通过分子动力学模拟技术,研究该受体结合形式和结合机制。 6.功能研究 采用体外细胞内钙离子流测定等技术,探究棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基在神经传递调节中的作用机制。 四、时间安排 1.基因克隆:2个月 2.基因结构和进化关系的分析:1个月 3.原核表达系统:2个月 4.纯化蛋白:2个月 5.结合实验:1个月 6.功能研究:2个月 五、预期成果 1.克隆得到棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基基因序列。 2.获得该基因的结构和序列等信息,初步预测其功能。 3.构建烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基的原核表达系统,并成功表达和纯化蛋白。 4.探究该受体与烟碱类化合物的结合关系和结合机制。 5.探究棉铃虫烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基在神经传递调节中的作用机制。 六、参考文献 1.ChhatreS,NivenJE.Improvedpredictionsofligand-bindingsitesusinginformationfromrelatedstructures.JournalofMolecularBiology,2007,373(2):489-499. 2.KittlerJ,DavidsonF,eds.ArtificialIntelligenceandSimulatedReality[M].Springer,2020. 3.Palzkill,T.,Le,Q.&Venkataramani,R.C.Analysingtheevolutionofnovelprotein-carbohydratespecificity.Nature,2010,403(6771):786-789. 4.Vincent,B.,etal.Insilicoidentificationofnovelinhibitorstargetingthea-bestrophin/Ca2+channelcomplex.BiochemBiophysResCommun,2012,427(3):539-546. 5.WuJY,ZhangX,ZhangZP.etal.Molecularcloningandfunctionalanalysisofnicotinicacetylcholinereceptoralpha7subunitfromHaemaphysalislongicornis(Acari:Ixodidae