分子印迹渍与分子杂交技术.ppt

固相支持物应具备的特点：几种常用固相支持物2)尼龙膜（nylonmembrane）
结合单链DNA和RNA的能力比NC膜强（达350µg/
cm2～500µg/cm2）。
真空烘干后或紫外线照射可强化结合（短波UV照射后,
部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加牢固）。
微波处理和碱处理也可促结合，从而使细菌裂解、DNA
变性与固定一步完成（菌落原位杂交）。
韧性较强，操作方便。
能结合小分子核酸。
低盐也能很好结合（可用于核酸电转移）。
可反复杂交和洗膜。
－－杂交本底较高3)化学活化膜（chemicalactivatedmembrane）
将虑膜用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜（如ABM和APT纤维素膜），这种化学活化膜经特殊处理而活化，产生活化基团（重氮盐）与DNA或RNA分子共价结合。
DNA与膜共价结合，反复多次使用不会损耗太多。
对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力（NC、NL不具备)
－－结合能力较NC膜低
－－活化过程较复杂是指将核酸,蛋白质等生物大分子固定在纤维膜上的过程。将核酸或蛋白质从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。印迹（渍）技术
EasternBlot
（1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern印迹。）
DotBlot
Insituhybridization
固相核酸印迹杂交类型流程
1.将核酸分子酶切成为多个片段
2.变性电泳（或者电泳之后变性），使各片段分离
3.将凝胶中的核酸片段转移到固相支持物上
4.预杂交
杂交
5.洗膜
6.检测流程
1.将核酸分子酶切成为多个片段
2.变性电泳（或者电泳之后变性），使各片段分离
3.将凝胶中的核酸片段转移到固相支持物上
4.预杂交
杂交
5.洗膜
6.检测固相核酸分子杂交类型斑点杂交（Dotblot）
斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot(Bio–Rad)和Hybri–Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。（1）DNA斑点杂交
①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。
②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每个样品一般点50μl（2～10μgDNA）。
④将膜烘干，密封保存备用。
RNA斑点杂交：
1）与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化）。
2）将RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含0.15mol/l甲醛）使RNA变性。
3）然后取5～8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。一种简化的提取和纯化RNA的方法
用含0.5%NonidetP40（诺乃洗涤剂）的低渗缓冲液对动物细胞作简单处理，离心去掉细胞核和细胞碎片，就得到基本不带DNA而富含RNA的细胞质提取物，这一粗RNA在高盐下用甲醛变性，不需加工直接点到硝酸纤维素膜上。本法可以快速检测大量标本，而只需极少量的细胞（5×104）或组织。
整个RNA实验中，要防止激活内源性Rnase。固相核酸分子杂交类型菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。实验步骤如下：
①将滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。
②培养细菌至产生1～2mm大小的菌落。
③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下，轻轻置于滤纸上，菌落面上在，注意防止在滤膜底面存有气泡。
④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/lNaCl,0.5mol/LTris·NaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。
⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/lNaCl,0.5mol/LTris·HCl，pH8.0）浸湿的滤纸上，放置10min。重复中和1次。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min。SSPE配成20×贮备液：3.6mol/lNaCl,0.2mol/LNaH2PO4(PH7.4),20mmol/LEDTA(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。固相核酸分子杂交类型组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性