利用基因敲放技术建立胰岛β细胞特异表达的Cre重组酶转基因小鼠模型的任务书.docx

利用基因敲放技术建立胰岛β细胞特异表达的Cre重组酶转基因小鼠模型的任务书
一、项目名称：利用基因敲放技术建立胰岛β细胞特异表达的Cre重组酶转基因小鼠模型
二、项目背景和意义
糖尿病是一种全球性的慢性代谢性疾病，其中1型糖尿病是一种由自身免疫反应导致胰岛素分泌细胞（包括胰岛素分泌β细胞、胰高血糖素分泌α细胞以及生长激素分泌δ细胞）破坏和减少从而导致绝无治愈的疾病。治疗1型糖尿病的有效手段是胰岛细胞移植，因为胰岛细胞移植可以恢复1型糖尿病患者胰岛素的分泌功能。但这个方法有一个很大的缺陷，那就是由于目前胰岛组织来源有限，因此无法为大多数需要此方法治疗的患者提供足够的治疗灵敏度和精度。
因此，利用基因敲放技术建立胰岛β细胞特异表达的Cre重组酶转基因小鼠模型的意义在于：
1.这将有助于深入研究胰岛β细胞分布范围和分泌机理，并分析推动分泌或基因转录和调节发生变化的细胞信号通路。
2.建立这个模型可以为胰岛细胞的基础生物学研究和糖尿病的新治疗策略提供支持。
三、研究方案
1.方法
选用Cre/loxP重组技术，在胰岛素基因Promoter的5'末端放入Cre重连酶并构建成启动元件对胰岛素分泌细胞其beta细胞特异表达；对Cre重连酶-Gfp地表达物的酶流观察和常规方法常规方法和实时荧光定量PCR分析筛选、监控和证实表达Cre重连酶。
2.实验过程
2.1.构建Cre重连酶转座载体
-荧光素酶-β-galactosidase（EDTG）信号Peptide的为了优化克隆筛选基因控制元件的选用。
-CaseinKinaseII动态状态修饰结构域的磷酸化起始启动子对于Cre重连酶的输送有利。
-制造基础克隆，同时在胰岛素I和开沃金序列中插入Cre重连酶。在基础克隆和修饰后的克隆中都加入荧光素酶-β-galactosidase控制元件作为高度检测的转基因操纵的克隆筛选信号。
-将构建的Cre/loxp转座载体，包含基粒、荧光素酶-β-galactosidase和CHRNA7控制元件、胰岛素IPromoter和Cre重连酶序列，用电转法转化到银杏树上。对转化的细胞进行筛选。挑选表达高荧光蛋白的转基因银杏细胞株。（后期测试Cre重连酶在银杏细胞中是否有效）
-利用Cas9和sgRNA（GATA4targetsequence）进行基因敲打，敲打β-细胞内分泌素1a（IAPP）基因，试验观察IAPP基因删除的后果。
-把Cre/loxp转座载体注射到小鼠受体孕育的胚胎细胞中进行克隆。接着，把克隆的胚胎囊泡回植进母鼠体内，等待分娩并培养接受注射的胚胎生长。
-小鼠分罐且对3周的小鼠进行Cre重连酶注射和分离胰腺。接着，对Cre重连酶的表现和Gfp表现的监视，在胰岛细胞实时检测Cre重连酶的有效性。（后期检验Cre重连酶在小鼠Beta细胞中是否有效）
四、研究内容
1.建立胰岛β细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠模型。
2.检测Cre重连酶在转基因银杏细胞上的表达水平，通过酶流观察和定量PCR分析证实Cre重连酶的有效性。
3.通过基因敲打β-细胞内分泌素1a（IAPP）基因，来了解Cre重连酶的基因表达活性，观察它对细胞缺陷的潜在改善。
4.尝试通过Cre重连酶表达的胰岛内细胞调查，以及植入胰岛分离技术获得数据并了解模型的病理特征。
五、研究预期结果及重点难点
两年的时间内，预期完成紫外过滤和等光晕/等伽马响应筛选克隆的任务。成功建立表达Cre重连酶的胰岛β细胞特异性转基因小鼠模型，证实Cre重连酶在银杏基因组方面的有效性，以及对下游基因敲打的效力，分离胰腺，探索Cre重连酶表达小鼠细胞中beta细胞异质性的潜在在生化和物理学方面的属性特点。
其中，关键和难点部分就在于在银杏细胞中验证Cre重连酶的表达效力和大体的小鼠模型的建立和银杏基因的实验结果的高度相关性。
六、预期效益
成功建立胰岛β细胞准确表达Cre重连酶的小鼠模型。对基础生物学研究和糖尿病的新治疗策略提供支持。建立的贡献包括：
1.该项目将有助于深入研究胰岛β细胞分布范围和分泌机理，并分析推动分泌或基因转录和调节发生变化的细胞信号通路。
2.该项目以银杏作为胰岛细胞模型，有助于弥补因供给和表达等原因难以获得的其他胰岛细胞模型的局限性。
3.该项目有望提供对1型糖尿病治疗的新思路和策略，为对糖尿病治疗的现有方法的补充和完善提供创新性想法。
4.该项目建立了一种新的熟悉而易及的胰岛细胞模型，有助于未来同类研究的推进和相关治疗策略的开发。