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产5--氨基乙酰丙酸重组毕赤酵母的构建及发酵研究的开题报告
一、研究背景及意义
毕赤酵母作为一种单细胞真菌，具有较高的生长速度和良好的基因操作性能，因此被广泛应用于工业生产和科学研究中。近年来，随着基因工程技术的发展，研究人员利用毕赤酵母重组表达外源基因成为了一种研究生物化学和分子生物学的常用方法。因此，构建一种能够高效表达特定基因的重组毕赤酵母菌株，对于生物医药、食品工业和能源生产等多个领域有着重要的意义。
在众多基因工程领域的应用中，生物所需要的氨基酸是比较重要的一类，5--氨基乙酰丙酸作为一种氨基酸分子，广泛运用于蛋白质工业、食品添加剂等领域。因此，针对5--氨基乙酰丙酸分子的高效生产十分重要。利用基因工程技术构建重组毕赤酵母，进行5--氨基乙酰丙酸的高效表达和发酵生产，将有助于提高其产量和生产效率，达到成本降低、提高产值的目的。
二、研究内容和方法
本研究拟构建一种高效表达5--氨基乙酰丙酸的重组毕赤酵母菌株。具体研究内容和方法如下：
1.克隆5--氨基乙酰丙酸合成酶基因ACS2
(Acetolactatesynthase2)。利用基因克隆技术，从天然产生5--氨基乙酰丙酸的微生物中克隆酶基因ACS2，并将其量化挂载于表达载体上。利用限制性内切酶的酶切，验证所克隆的基因序列的准确性。
2.转化ACS2重组质粒至毕赤酵母。采用电转化的方法将表达载体中的基因构建转化到毕赤酵母细胞中，得到重组毕赤酵母菌株。利用PCR技术和基因测序技术，验证重组毕赤酵母中的外源基因ACS2是否被成功转化。并进行多次纯化、筛选，筛选出具有最高表达能力的重组毕赤酵母菌株。
3.酶活力测定和表达量检测。利用酶活力测定方法和Westernblotting技术，检测构建的重组毕赤酵母菌株中5--氨基乙酰丙酸合成酶基因ACS2的表达量、酶活力和酶结构。最终筛选出产生5--氨基乙酰丙酸最高的菌株，进行大量发酵实验。
4.液态发酵过程的优化与角质素分离提取。将优化好的重组毕赤酵母菌株进行大规模液态发酵，研究其产酸规律及最优发酵条件，探求胞内产生5--氨基乙酰丙酸的最佳发酵参数。利用分离技术将5--氨基乙酰丙酸提取出来，并采用合成化学方法将其转化为实用的食品添加剂。
三、预期研究结果和意义
本研究的预期结果为：构建一种能够高效表达5--氨基乙酰丙酸的重组毕赤酵母菌株，并进行多次筛选和优化，最终获得产量最高的毕赤酵母菌株。并通过角质素分离提取的方法，将5--氨基乙酰丙酸提取出来并合成为实用的食品添加剂。这一部分的实验数据将会提供给食品添加剂企业，为其在五氨基乙酰丙酸生产的技术上提供重要依据。
本研究的意义为：①将利用基因工程技术构建出一种高效合成5--氨基乙酰丙酸的毕赤酵母菌株，为生产工业和科研提供方便；②研究出5--氨基乙酰丙酸合成途径分子机制，深入了解酶合成机理和代谢调控；③提供了基于毕赤酵母的5--氨基乙酰丙酸高效生产的方法，对于未来的产业应用和规模生产也具有重要的参考意义。
四、进度安排
本研究计划为期12个月，进度安排如下：
1-3个月：学习相关理论知识，调查了解研究现状。
4-7个月：进行基因克隆、转化实验，筛选重组毕赤酵母菌株。
8-10个月：酶活力测定和表达量检测。
11-12个月：进行毕赤酵母大规模液态发酵、角质素分离提取等实验。
五、存在的问题及解决方法
本研究中存在的问题主要包括：①毕赤酵母表达载体的选择；②ACS2重组质粒的转化效率；③菌株的纯化、筛选；④角质素分离提取的方法等问题。通过科学合理地设计实验和技术手段，探究问题的研究策略和解决方案，提高实验精度和产量效率。
六、参考文献
1.黄琳琳.细胞工程技术在酶制剂生产中的应用[D].中国林业科学研究院,2008.
2.熊瑞雄.基因组学时代的生工学[J].生命的化学，2004，24（1）：99-102.
3.李伟祥，陈璐.基因工程菌株的构建和应用[J].食品工业，2009，30（1）：106-108.
4.WoodwardJ,OrrM,CorduasE,etal.OptimizationofglycerolproductionbyCandidautilisinfed-batchculture[J].Bioprocessengineering,2015,38(3):355-364.