植物基因工程.docx

第六章植物基因工程课程基因工程原理与技术班级生物科学05生物技术05教师詹亚光范桂枝学期第二学期课时6学时上课日期课的类型理论授课章节第六章植物基因工程（1）植物基因转化受体系统的条件（2）植物基因转化受体系统的类型和特性。（3）植物基因工程载体的种类和特性（4）根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能：T-DNA、Vir区操纵子的基因结构与功能。（5）农杆菌Ti质粒基因转化机理（6）农杆菌Ti质粒的改造及载体构建（7）载体构建中常用的选择标记及报告基因（8）根癌农杆菌的转化程序及操作原理（9）外源基因在植物中的表达教学目的和要求了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti质粒的结构与功能植物载体构建原理植物基因工程常用的载体类型。教材分析重点根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的原理和方法难点植物载体构建原理关键点转基因植物的获取和检测主要教具和设备材料投影仪、电脑、常规教学设备教法板书与多媒体授课相结合思考题1.植物基因工程载体种类？2.根癌农杆菌转化程序？心得在自然界的许多双子叶植物中常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。已知90多科600多种双子叶植物都能感染这种病。一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。70年代中期世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducingplasmid)且证实了肿瘤的形成正是由于pTi中的特定片段——T-DNA转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。农杆菌将自身的DNA插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的重要原因之一是因为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。植物自身不能利用这种物质只能为它的合成付出代价别的细菌也不能利用它在自然条件下只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。肿瘤的产生是由于T-DNA上的激素合成基因所致刺激细胞生长而产生肿瘤这是T-DNA转入的一个副产品。Ti质粒给自己设计出一套为其自身存活的非常优秀的进化格局：它感染植物细胞使之出现愈伤组织增生后者便产生出供带有Ti质粒的细菌用作能源、碳源和氮源的冠瘿碱；而冠瘿碱的产生又可激发Ti质粒转移到原先没有存在这种质粒的土壤农杆菌中去如此周而复始得到不断发展。Ti质粒是一类理想的植物基因工程载体通过它们可以将外源DNA转移到植物细胞并再生出能够表达外源基因的转基因植物。Ti质粒还具有若干其他载体所不具备的优点：（1）T-DNA能够进行高频的转移而且这种转移的DNA通常是以未发生变化的完整形式整合到植物的核基因组上。（2）Ti质粒不存在包装限制问题大到50kb的外源DNA也能顺利地包装与转移。一、植物基因工程载体种类据载体的功能和构建过程可把有关载体分为四大类型（九种载体）。克隆载体、中间载体、卸甲载体、转化载体据载体的功能和构建过程可把有关载体分为四大类型九种载体。1、克隆载体（目的基因的克隆载体）通常由多拷贝的E.coli小质粒为载体功能：保存和克隆目的基因。2、中间载体又分为中间克隆载体和中间表达载体。中间克隆载体：由大肠杆菌质粒插入T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成。功能：构建中间表达载体的基础。分为：中间粘粒载体、质粒粘粒愈合载体、基因标记载体。中间表达载体：含有植物特异启动子的中间载体功能：作为构建转化载体的质粒。3、卸甲载体解除武装的Ti质粒或Ri质粒。（onc+--------onc-）功能：作为转化载体的受体质粒4、转化载体最后用于目的基因导入植物细胞的载体亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成。分为一元载体系统（顺式载体）和双元转化载体系统（反式载体）。一元载体系统包括共整合载体和拼接末端载体（SEV）。二、根癌农杆菌Ti质粒1、Ti质粒的类型、结构与功能（1）类型Ti质粒是根癌农杆菌染色体以外的遗传物质为双股共价闭合的环状DNA分子分子量为95~156x106D约150~200Kb长。根据其诱导的冠瘿碱种类不同Ti质粒可分为三类：章鱼碱型（octopine）：pTiAch5pTiA6NCpTiB653pTiAg162胭脂碱型（nopaline）：pTiT37pTiT38pTiC58农杆碱型（agropine）和农杆碱素型（agrocinopine）或琥珀碱型（succinamopine）（2）结构和功能各种Ti质粒都可分为四个区：①T-DNA区（transferred-DNAregions）：是农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。②Vir区（Virulen