植物基因工程.pptx

第六章植物(zhíwù)基因工程转基因植物
将外源基因导入植物细胞(xìbāo)，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。
抗虫
抗病
抗逆
生产药物外源基因：选择？克隆？
植物细胞：受体细胞的种类？
导入：方法？
组织培养：（略）
表达外源基因：如何检测、筛选(shāixuǎn)？

植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物生产的关键一、高等植物(gāoděngzhíwù)的遗传特性二、高等植物的基因(jīyīn)转移系统
Ti质粒介导的整合转化程序
植物病毒介导的转染程序(略)
植物细胞的直接转化程序
植物原生质体的再生程序（一）Ti质粒介导的整合转化程序
Ti质粒的结构与功能
双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌(gǎnjūn)农杆根瘤菌（）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒Ti质粒（Tumor-inducingplasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。（1）Ti质粒的图谱(túpǔ)区
整个质粒160-240kb
T-DNA区、
Vir区、
Con区、
Ori区①转移(zhuǎnyí)DNAT-DNA（transfer-DNA）②毒性(dúxìnɡ)基因（vir）第一步:植物受伤
乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti质粒的毒性基因表达。
第二步感染植物
脓杆菌吸附于植物的表面(biǎomiàn)伤口部位
第三步毒性基因（vir）表达

第四步T-DNA转移
单链T-DNA被切下来，整合到植物基因组中。
第五步诱导冠瘿瘤①野生型Ti分子大（200kb）操作起来十分麻烦；
②各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少；
③tms和tmr基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；
④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；
⑤无大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。（6）、Ti质粒的改造
除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成基因；
除去Ti质粒的其它非必需序列，
安装大肠杆菌复制子，
安装植物(zhíwù)细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物(zhíwù)基因的启动子和polyA化信号序列；
插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。改造后的Ti质粒载体(zàitǐ)模式①pGV3850
特点：外源基因不能直接插入，需要借助于pBR322质粒作为中间载体(zàitǐ)
选择标记
脓杆菌选择标记
宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体(zàitǐ)pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）
最终受体植物的选择标记
位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。外源基因(jīyīn)插入pGV3850的过程转化后可诱导愈伤组织(zǔzhī)分化成转基因植物
共
整
合
转
化
程
序
②双元载体（binaryvectors）
能在大肠杆菌(gǎnjūn)和农杆菌(gǎnjūn)中复制，是穿梭载体。
双元载体的结构
Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。
大幅度减小质粒的体积。（<10kb）双元载体的转化
基因插入(chārù)
转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。
帮助质粒（helperplasmid）
受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。
穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆位点、两个T-DNA
双元系统中的Ti具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。
接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒可在农杆菌内自主复制
插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤(gēnliú)农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。三、植物细胞的直接(zhíjiē)转化程序基因枪介导的DNA转移(zhuǎnyí)GeneGun电击法
将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织(zǔzhī)培养基中生长1-2周，再生出整株植物。融合法
将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合(hùnhé)，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。
所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。植物原生质体的再生(zàishēng)程序四.转基因(jīyīn)植物的基因(jīyīn)鉴定（一）利