流式细胞术样品制备(完整).ppt

流式细胞术的样品制备FCM的样品制备包括单分散细胞悬液制备技术，细胞生物学特征标记技术及荧光染色技术，FCM是对细胞或细胞器的结构和某些功能进行定量测定，并可以根据细胞亚群的特点性质对其进行分类的技术。

FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液，在FCM技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组织等。一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。二、实体组织单分散细胞的制备
㈠新鲜实体组织
新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采取的样品，此样品应及时进行适当的保存处理，如及时用固定剂或低温对组织进行保存，以避免由于室温过高、放置时间过长而造成组织自溶，影响检测结果。新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下：
⒈酶消化法
⒉机械法
剪碎法
网搓法
研磨法
⒊化学试剂处理法
⒈酶消化法
酶对实体组织分散作用原理主要有三方面：
﹡一是可以破坏组织间的胶原。
﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。
﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。
酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用的酶类试剂有：
•蛋白酶类，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞；
•胰酶，能水解脂键和肽键；
•胶原酶，能降解几种分子类型的胶原；
•溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键；
•弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的选择和影响因素：
※酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成酶效价降低
※注意组织在消化液中的消化时间
※注意酶活性的PH值
※注意酶的适用浓度
※随时注意影响酶活性的其他因素
各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的，不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的结构或功能产生不利的影响。酶学方法的一般程序：
①将适合于酶消化的组织置于离心管中。
②将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中。
③一般消化20-30分钟(恒温37ºC或室温)，消化期间要间接振荡或吹打。
④终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网(200目)过滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片。
⑤将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。⒉机械法
机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸细胞以分散细胞，采用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液中细胞碎片，所以机械法常与其他方法配合使用。常用的几种机械法制备过程如下：
剪碎法：
①将组织块放入平皿中，加入少量的盐水。
②用剪刀将组织剪至匀浆状。
③加入10ml生理盐水。
④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中。
⑤离心沉淀1000prm3-5分钟，再用生理盐水洗三次，每次以短时低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。
⑥以300目尼龙网过滤除去细胞团块。
⑦70%冰乙醇固定，放入4℃冰箱。网搓法：
①将100目铜网扎在小烧杯上。
②把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。
③用300目的尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块
④收集细胞悬液，离心沉淀1000prm，5分钟。
⑤70%乙醇固定，置4℃冰箱备用。研磨法
准备一只70ml组织研磨器
①将组织剪碎至小块。
②放入组织研磨器中，加入1-2ml生理盐水。
③转动研棒，研至匀浆即可。
④加入生理盐水10-20ml，冲洗研器。
⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800prm，1-2分钟，再用生理盐水洗三次，离心沉淀。⒊化学试剂处理法
化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用的钙镁离子置换出