流式细胞术的样品制备.doc

第二节流式细胞术的样品制备
节概述

待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记以及细胞凋亡检测样品的制备。
知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备
用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下：
(1)每份取100μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性对照样品。
(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，一般在室温下反应15～30min即可。
(4)加入500μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。
2.间接免疫荧光标记的样品制备
(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30min。
(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800～1000r/min，5min)。
(3)用100μlPBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30min。
(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500μlPBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
注意：以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，没有非常具体的规定，一般应根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可保存5d。
3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备
目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。下面主要介绍与流式细胞仪配套的QPREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：
(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100μl置12mm×75mm专用塑料试管中；②每份加入20μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性对照，室温下避光染色15min；③置QPREP仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min；④上流式细胞仪检测。
(2)微量全血间接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100μl置12×75mm专用塑料试管中；②加入50μl特异的第一单克隆抗体，室温下孵育30min；③置QPREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞；④离心(800～1000rpm，5min)弃上清液，用PBS洗涤细胞2次；⑤加入50μl荧光(FITC或PE)标记的第二抗体，室温下避光染色30min；⑥上流式细胞仪检测。
(3)注意事项：①新鲜全血保存时间：一般室温下放置8h以内可以使用，时间过长会使活性降低，影响测定结果；②抗凝血应保证无血块凝集；③全血加入试管中时，应尽量避免加到试管壁上，如沾到了管壁上必须用棉签擦干净，否则会影响细胞二维点图的细胞群的分离效果。
4.双标记(双染色)直接免疫荧光的样品制备
在流式细胞术分析中，由于双参数分析的光谱重叠现象和干扰因素相对增多，一般不采用间接荧光法制备细胞样品而是用直接法进行双标记染色。目前双标记的荧光探针较多，但一般采用FITC与PE标记的单抗组合，在进行双标记荧光染色的样品制备中，由于前面已述及到荧光补偿等问题，因此，不仅要制备阴性对照样品，而且必须制备阳性对照样品，以此先调整好流式细胞仪的工作参数，使测量得到的数据准确可靠。
全血的样品制备实验步骤如下：
(1)取肝素或EDTA抗凝人外周血样品100μl(2份)。
(2)1份加入CD4FITC/CD8PE的双标荧光抗体；另一份加入MsIgG1FITC/MsIgG1PE鼠抗人无关单抗(作阴性对照)混匀。在室温下避光染色15min。
(3)置QPREP样品制备仪上，快速自动溶解红细胞，稳定和固定白细胞。
(4)阳性对照样品的制备，取100μl肝素抗凝正常人全血，加入CD4FITC/CD8PE双标荧光单抗，染色法与2、3步骤相同。
(5)将制备好的样品上流式细胞仪检测。
5.培养细胞DNA荧光染色的样品制备
(1)培养细胞用0.25％的胰酶消化。
(2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次，再用PBS或生理盐水悬浮细胞，加入预冷的无水乙醇，终浓度为(60％～70％)，快速混匀，并用封口膜封口，置4℃下可保存15d左右。
(3)将固定过的细胞离心(800～1000r，5min)弃上清液，再用PBS洗涤2次。
(4)用PBS调整细胞浓度，每份为1×106个细胞/100μl。
(5)加入500μlDNA荧光染料(通常用Coulter