肠出血性大肠杆菌细菌外膜囊泡毒力因子的鉴定及功能初步探究的开题报告.docx

肠出血性大肠杆菌细菌外膜囊泡毒力因子的鉴定及功能初步探究的开题报告
一、研究背景
肠出血性大肠杆菌(E.coli)是一种引起人类和动物肠道感染的重要病原菌。其中的O157:H7菌株被广泛认为是致病性最强的一种，其产生的外毒素（Shiga毒素）造成了众多食物中毒事件，甚至会引发严重的急性肾衰竭和神经病变等后遗症。近年来，随着高通量基因测序技术的发展，人们发现E.coli菌株中还存在一类特殊的细胞外囊泡——细菌外膜囊泡(bacteriaoutermembranevesicles,OMVs)。这些囊泡能够携带E.coli的DNA、蛋白质和毒素等物质进入人体细胞，进而诱导细胞死亡，形成肠出血或腹泻等症状。因此，研究E.coli细菌外膜囊泡中的毒力因子，有望为防治E.coli感染提供新的思路和策略。
二、研究内容和目的
本研究的目的是从E.coli细菌外膜囊泡中筛选和鉴定肠出血性大肠杆菌的毒力因子，并初步探究这些因子对人体细胞的毒性作用和作用机制。具体研究内容包括以下三个方面：
（1）培养不同菌株及获得细菌外膜囊泡。
选取肠出血性大肠杆菌(E.coliO157:H7)和普通大肠杆菌(E.coliK-12)作为研究对象，分别在含有牛肉膏蛋白和唐氏培养基的液体培养基中进行静态培养。分别采用离心法和超滤法来收集不同菌株的细菌外膜囊泡。
（2）筛选和鉴定毒力因子。
利用质谱分析技术对肠出血性大肠杆菌(O157:H7)和普通大肠杆菌(K-12)的细菌外膜囊泡进行分析，并利用生物信息学技术进行生物学、化学和功能分析。筛选出与外膜囊泡相关的毒力因子。
（3）初步探究毒力因子对人体细胞的影响及其作用机制。
选择HEK293细胞(从人胎肾上皮细胞分离)和RAW264.7细胞(从小鼠巨噬细胞系中分离)作为研究细胞，用酶联免疫吸附实验(ELISA)和细胞增殖实验对毒力因子的毒性和凋亡效应进行分析，同时用荧光显微镜观察外膜囊泡进入细胞的过程。
三、意义和价值
肠出血性大肠杆菌相关的外膜囊泡毒力因子的研究对于人类健康具有重要意义。一方面，了解这些毒力因子的物质基础和生物作用机制，有望为开发新型的肠道疾病防治药物提供有力支持。另一方面，本研究可以为制定切实可行的饮食安全措施，防止食品污染事件的发生和流行提供新思路。
四、研究方法和技术路线
（1）细菌培养及外膜囊泡的制备
分别培养肠出血性大肠杆菌和普通大肠杆菌，并用离心法和超滤法分别收集不同菌株的细菌外膜囊泡。
（2）质谱分析技术鉴定毒力因子
将细菌外膜囊泡经过某些化学改变之后，利用质谱分析技术分析其组成成分，然后采用生物信息学技术进行生物学、化学和功能分析，找出和毒性相关的化学成分。
（3）细胞实验研究
将细胞培养物中的囊泡与HEK293和RAW264.7细胞共同孵育，观察外膜囊泡进入细胞的过程，同时观察肝细胞是否会受到外膜囊泡的影响。
五、预期成果
本研究的预期成果如下:
（1）成功获得肠出血性大肠杆菌和普通大肠杆菌的外膜囊泡和荧光等标记物。
（2）成功鉴定出E.coli细菌外膜囊泡中的毒力因子，探究其对人体细胞的作用机制。
（3）为防治肠出血性大肠杆菌病提供新的思路和策略。
六、研究计划
本研究计划在两年内完成，分以下四个阶段：
（1）第一年：细菌培养及外膜囊泡的制备。
（2）第二年：囊泡组成物的分析和功能初步研究。
（3）第三年：细胞实验及其相关机制的初步研究。
（4）第四年：完善实验数据和撰写论文，进行撰写并发表文章或与有关单位合作开发新药品策略。