荧光定量PCR原理及应用.pptx

实时荧光定量PCR的基本原理在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图.荧光背景信号阶段：为扩增最初的10～15个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，到达荧光阈值的CT值越小，反之越大。定量方法其他定量方法荧光定量PCR检测模式检测模式
在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBRGreenI工作原理水解探针模式（Taqman）一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信号的产生，随着循环数增加，荧光信号不断积累。分子信标探针模式模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和淬灭基团紧紧靠近而被淬灭。当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。引物设计原则Taqman探针设计原则实时荧光定量PCR的应用2.基因表达差异分析:例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证.
3.基因分型:例如SNP检测，甲基化检测等。感谢您的观看！内容总结