糖蛋白的提取分离纯化与表征终稿.doc

糖蛋白的提取分离纯化与表征
摘要：糖蛋白是由寡糖链与多肽链共价连接而成的一类结合蛋白质，是一类重要的生物大分子，在生物体内占有重要地位。本文综述了糖蛋白的分类、分离纯化及纯度鉴定方法研究，并介绍了某些糖蛋白的生理活性，对糖蛋白的开发利用具有借鉴作用。
关键词：糖蛋白，提取，分离纯化，纯度鉴定，生物活性
1糖蛋白的简介
1.1糖蛋白的定义
糖蛋白是由小于15个单糖单位的寡糖链与蛋白质以共价键连构成的复合分子，在组成上以蛋白质为主。与其他大分子相比，糖蛋白的定义一直比较模糊，直至1908年美国生物化学家协会首次将糖蛋白定义为：由蛋白质分子和除核酸外的含有碳水化合物基团的物质共同组成的复合物(compoundsoftheproteinmoleculeswithasubstanceorsubstancescontainingacarbohydrategroup,otherthannucleicacid)(Montreuileta1.,1995)。糖含量在不同糖蛋白中差别较为明显，通常情况下，总糖含量占蛋白重量的1％-60％不等，举几个例子：胶原蛋白含糖量一般不到1％，免疫球蛋白G低于4％，人红细胞膜的血型糖蛋白含糖量在54％左右。
随着糖和蛋白复合物领域研究的逐步深入，研究者将蛋白聚糖和糖蛋白区别开来，糖蛋白专指由比较短(通常不会超过15个单糖单位)、通常情况下具有多个分支的寡糖链与多肤链以共价键相连接的，含量上以蛋白为主的复合物；而蛋白聚糖在组成上以糖为主，且其糖链类型和连接方式均与糖蛋白有区别。近年来，糖蛋白的研究成为多门学科的研究前沿领域。相关研究者在医药学、生物化学、细胞生物学、免疫学以及食品科学领域都渗透进了糖蛋白的相关研究。
1.2糖蛋白的分类及分布
糖蛋白的主要由糖链和肽链两大部分构成。构成糖蛋白的单糖主要有(陈惠黎主编，1997)：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、N-乙酞葡萄糖胺、以及糖醛酸等。糖蛋白中较短的糖链和较长的肽链是通过糖肽键共价连接的。糖蛋白中按糖肽键连接方式不同糖蛋白可分为N-连接型糖链和O-连接型糖链，(1)N-连接型糖链糖蛋白：其特点是以天冬酞胺的酞胺基、N-末端氨基酸a-氨基以及赖氨酸或精氨酸-氨基为连接点，形成N-糖苷键型糖肽键，此类型糖蛋白糖链一般由以G1cNAc6为还原端，由六个到十个糖基构成；(2)O-连接型糖链糖蛋白：其结构特点是以苏氨酸、丝氨酸、和羟赖氨酸的轻基为连接点，形成O-糖昔键型。
在自然界中，糖蛋白以各种形式存在于细胞间质、细胞膜、血液及粘液中，包括许多激素、免疫球蛋白、粘液、结构蛋白、受体组分等。
1.3糖蛋白生物学功能
糖蛋白及其复合物是一类重要的生物活性物质，糖蛋白作为一种糖和蛋白质的复合物，具有多方面的生物活性，如抗氧化、免疫调节作用、体外抗肿瘤活性、抗糖尿病活性等，糖蛋白它可以存在于植物的细胞中，也可以存在于动物和微生物的细胞中，具有开关和调谐功能、激素功能、胞内转运功能、保护与促进物质吸收、参与血液凝固、参与细胞识别一系列作用。
2糖蛋白的提取
糖蛋白的提取就是将糖蛋白从原料中分离出来的过程。包括以下几个阶段，材料的选择和预处理，细胞的破碎，提取，浓缩，沉淀，干燥。糖蛋白是一类结合蛋白，兼有多糖和蛋白质的某些性质，大多可溶于水及稀盐、稀酸和稀碱溶液等，因此可根据需要采用不同的溶剂提取分离糖蛋白。但要注意，在所有这些步骤中必须保证糖蛋白生物大分子的完整性，防止过酸、过碱、有机溶剂、高温、剧烈机械作用等破坏糖蛋白的结构而导致目的产物的生物活性丧失。常用的提取方法有：水提取法、稀盐溶液或缓冲液浸提法、酸碱溶液提取法、酶解法提取等。
2.1水提取法
由于糖蛋白中糖链的高度亲水性（组成膜的糖蛋白除外），因此可用不同温度的水提取糖蛋白。有时在提取之前需要对原料进行脱脂处理，常用的方法是醚或醇回流。有报道，将藤壶全脏器匀浆，称取100g，加入600mL蒸馏水，于60℃下浸提4h，8层纱布过滤离心（12000r•min-1，20min，4℃，以下离心条件皆相同）,浓缩，无水乙醇沉淀24h，离心，沉淀冻干等步骤获得糖蛋白质粗品[1]；称取印尼白燕盏燕窝粉末0.2g，加入20mL蒸馏水，60℃浸提6h，10000rpm离心20min取上清液，重复提取三次，合并提取液，冻干得燕窝糖蛋白粗品[2]；取黄芪药材，粉碎成絮状，取一定量加水浸泡12h，于<55℃水浴浸提2次，合并提取液，过滤，滤液离心(3000r·min-1，30min，下同)，浓缩上清液，加(NH4)2SO4至过饱和，于4℃静置过夜，离心，取沉淀，加适量水溶解，经sevage试剂脱蛋白，重复3次，直至无变性蛋白，将上清液置于透析袋透析，冷冻干燥，即得黄芪糖蛋白(AmGP一2)粗品[3]；称取一定量的怀山药片，加适量