核酸的分离提取及纯化.ppt

主要内容核酸（nucleicacid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。1核酸分离、纯化原则1.2防止核酸的生物降解1.2.1DNA酶抑制剂1.2.2RNA酶（RNAase)抑制剂(2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4℃或液氮中；
3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。
4）剧毒。（3)肝素
（4）复合硅酸盐（Macaloid)
（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）
（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)(1)高速组织捣碎机捣碎
(2)玻璃匀浆器匀浆
(3)超声波处理法
(4)液氮研磨法
(5)化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）
(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2.2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。2.2.1加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；2.2.3酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。(1）使用注意
酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
(2）安全操作
酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。2.3核酸的沉淀2.3.1核酸沉淀的盐类及浓度2.3.2有机沉淀剂（2）异丙醇（3）聚乙二醇（PEG）（4）精胺2.3.3核酸沉淀的温度和时间2.4核酸的浓度测定紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤A：测DNA：
纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／OD230应大于2.0。
1)OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。
2)小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；
3)OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。B：测RNA
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之间，OD260/OD230比值应大于2.0。
1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；
2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；
3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。2.4.2溴乙锭荧光法测定核酸的含量2.5核酸的保存