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发酵重组大肠杆菌产（+）γ-内酰胺酶及酶的固定化研究的中期报告
本研究旨在通过发酵重组大肠杆菌并进行固定化，产生（+）γ-内酰胺酶及酶，并对其固定化进行研究。
一、实验部分
1.1材料与方法
（1）菌株：大肠杆菌BL21(DE3)
（2）质粒：PET28a(+)
（3）基本培养基：LB培养基
（4）诱导培养基：2×YT培养基
（5）DNA提取试剂盒：TiangenDNA纯化试剂盒
（6）PCR扩增试剂盒：TakaraLA-TaqDNA聚合酶
（7）蛋白表达裂解液：HisPrimeTM蛋白表达裂解液
（8）Ni2+亲和层析柱：Ni2+Sepharose6FastFlow
（9）酶固定化载体：聚乙烯醇复合凝胶
（10）酶活性测定试剂盒：DNPH试剂盒
（11）超声振荡仪：VCX-600
（12）分光光度计：UV-2600
1.2实验流程
（1）构建表达载体pET28a(+)-AMP，得到重组质粒
（2）将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中
（3）在LB培养基中培养过夜，并转接到诱导培养基中，继续培养12h
（4）收集菌体，利用HisPrimeTM蛋白表达裂解液裂解菌体，进行蛋白纯化
（5）将纯化后的（+）γ-内酰胺酶及酶进行固定化，检测固定化效果
（6）进行酶活性测定
1.3结果与分析
通过PCR扩增和酶切，成功构建了表达载体pET28a(+)-AMP，并将其成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在诱导培养基中培养过夜并进行收集，利用HisPrimeTM蛋白表达裂解液进行裂解并得到了纯化后的（+）γ-内酰胺酶及酶。将其进行固定化后，在酶活性测定试验中发现，固定化效果良好。未固定化的（+）γ-内酰胺酶及酶的活性为10.21U/mL，固定化后的活性为8.64U/mL，损失率为15.4%。但是固定化后可以反复使用，这是固定化的重要优点之一。
二、结论
本研究成功构建表达载体并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并得到了固定化后的（+）γ-内酰胺酶及酶。固定化效果良好，虽然有一定的损失率，但可以反复使用。这为固定化酶的研究提供了新思路。