小鼠脾细胞培养实验.doc

山东大学实验报告2011年3月30日姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177同组者张少华科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等初步掌握无菌操作方法。实验原理细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官经体外培养后直到第一次传代为止。这种培养首先用无菌操作的方法从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化分解成单个游离细胞在人工培养下使其不断的生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法简便易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理但无论采用何种办法都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法根据染色机理的不同染料或使死细胞着色或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜对细胞起保护和屏障作用只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后细胞膜受损通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝又称锥蓝是一种阴离子型染料不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料氧化型为蓝色还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用使细胞内具有较强的还原能力能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞则因它们的无还原能力或还原能力极弱使美蓝处于氧化态从而被染成蓝色或淡蓝色。除此之外还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料可以使活细胞液泡着红色而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染染料弥散于整个细胞中细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用如甲基蓝-中性红混合染色法。实验器材剪子棉球75%酒精移液枪无菌操作台正置光学显微镜倒置光学显微镜解剖盘滴管离心管离心机注射器Eppendorf管培养皿酒精灯塑料培养皿载玻片盖玻片血细胞计数板等。实验材料小鼠1只细胞培养液（含生长因子）TrypenBlue染液PBS缓冲液实验步骤细胞的原代培养取材：取小鼠一只采用断头法处死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min取出转入超净工作台内的解剖盘中无菌操作打开腹腔取出其脾脏除去其周围的脂肪组织并用PBS液自上而下淋洗1-2次转入无菌培养皿中待用。分离脾细胞：用滴管向培养皿中注入30滴PBS缓冲液再用’L’型针头注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾脏注射时沿长轴注射。然后再用针头在脾脏上扎眼并用’L’型针头轻轻刮出脾细胞。在均匀吹匀脾脏细胞。吸取上述分离的单个脾细胞悬液放入Eppendorf管中使量至1mL以1000r/min离心5min。培养脾细胞：取塑料培养皿一套用移液枪吸取培养液2mL加入塑料皿中并将皿标记待用。取离心后的Eppendorf管弃去上清液用移液枪（200ul）吸取塑料皿中的培养液400ul加入弃去上清的Eppendorf管中用枪头吹匀管底的脾细胞吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料皿中混匀后放入37°C5%CO2的培养箱中培养。细胞死活鉴定及计数试剂配制：用生理盐水配成5%TyrpenBlue染液备用。染色计数：取0.5mL细胞悬浊液放入试管中加入1-2滴染液。混合。2-5min后将细胞放在血细胞计数板上观察死活情况注意不要有气泡产生放大倍数为10x10。染色后活细胞不着色死细胞显示蓝色。注意染色时间不能超过15min否则染液将细胞毒杀。计数：在10x10倍的显微镜下观察计算血细胞计数板的4个4小方格的细胞数量。包括细胞总数与死细胞数量。压线者计上不计下计左不计右。计算细胞活力：根据公式：图1.血细胞计数板示例图注意事项1、严格进行动物消毒需用75%