拟蜘蛛牵丝蛋白基因的原核表达及多克隆抗体制备的中期报告.docx

拟蜘蛛牵丝蛋白基因的原核表达及多克隆抗体制备的中期报告
一、实验目的
本实验旨在利用原核表达系统表达拟蜘蛛牵丝蛋白基因，以及利用这一表达产物制备多克隆抗体。
二、实验步骤
1.基因克隆与构建表达载体
利用PCR扩增拟蜘蛛牵丝蛋白基因的编码区域，并设计引物在5’和3’端添加的适当限制酶切位点，使扩增产物能够方便地与表达载体连接。将扩增产物和表达载体进行双酶切，并进行连接，得到重组表达载体。
2.原核表达
将重构后的表达载体转化至大肠杆菌等常用原核表达系统中，并利用靶向蛋白的旗标标签及抗生素筛选方法，筛选出表达目标蛋白的高效转化菌株。
3.蛋白纯化与检测
利用蛋白纯化技术纯化表达蛋白，利用SDS-PAGE检测纯化产物并观察纯化产物的免疫反应性质。
4.抗原免疫和抗体制备
将纯化产物进行亲和层析柱或凝胶渗透层析纯化，得到高纯度的抗原，之后将抗原注射至家兔等动物体内，在一定时间内收集血样，利用ELISA等方法确定免疫状态并收集血清，进行蛋白的多克隆抗体制备。
三、进展情况
本实验正在进行中，目前已成功扩增出拟蜘蛛牵丝蛋白基因的编码区域，并利用限制酶切位点与表达载体构建了重构表达载体。接下来将进一步地将表达载体转化至大肠杆菌中，进行表达筛选和纯化，最终利用纯化产物制备多克隆抗体。
四、存在问题
1.拟蜘蛛牵丝蛋白基因的表达情况和产物纯化情况尚未确定。
2.动物免疫过程中的免疫反应性质尚未确定。
五、下一步计划
1.利用PCR扩增出目标基因的编码区域，并将其与表达载体构建起完整的表达载体。
2.将表达载体转化至大肠杆菌、筛选出表达目标蛋白的高效转化菌株，并进行蛋白纯化。
3.收集纯化产物制备多克隆抗体，利用Westernblot、ELISA等方法检测抗体的特异性和亲和力等性质。
4.进一步了解上述问题的原因和解决方案，优化实验流程。