异常凝血酶DCP单克隆抗体的制备及鉴定的中期报告.docx

异常凝血酶DCP单克隆抗体的制备及鉴定的中期报告
一、背景
凝血酶是血液凝固过程中的关键酶之一，它的活性可通过凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）等检测方法进行定量测定。异常凝血酶活性可能导致出血或栓塞等疾病。因此，凝血酶在临床诊断和治疗中具有重要意义。DCP（Domainofunknownfunction,ConA-likeprotein,andPentaxin）是一类高度保守的Ca2+结合蛋白，已在多种哺乳动物中鉴定并广泛研究。研究表明DCP蛋白与血液凝血、炎症反应等生理过程密切相关。然而，目前缺乏对DCP在凝血酶活性中的作用的深入研究，并且缺乏特异性和高亲和力的单克隆抗体用于DCP的检测及功能研究。因此，本研究旨在制备和鉴定特异性的抗凝血酶DCP单克隆抗体。
二、方法
1.DCP蛋白的表达和纯化
基于质粒pET28a-DCP进行pET28a系统的蛋白表达。重组蛋白经His标签亲和柱纯化并鉴定纯度。
2.动物免疫和脾细胞融合
Balb/c小鼠免疫后，采用脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0的融合方法制备杂交瘤细胞。
3.单克隆抗体的筛选和鉴定
对杂交瘤培养物进行限稀稀释，筛选出单抗克隆。通过酶联免疫吸附实验和Westernblot分析确认抗体的特异性。
三、结果
1.DCP的表达和纯化
重组蛋白经Ni2+-NTA亲和柱纯化后，SDS-PAGE和Westernblot分析结果显示，单一条离子交换层析后分子量约为18kDa，Purity＞90%。
2.单克隆抗体的鉴定
通过limitingdilution法筛选到1株单克隆抗体并扩增。Westernblot分析显示该抗体对DCP进行特异性识别，抗体与DCP呈现明显的结合反应。
四、讨论
本实验成功地制备并鉴定出特异性的抗凝血酶DCP的单克隆抗体，为后续DCP蛋白在凝血酶活性中的作用研究提供了基础。此外，由于DCP在炎症反应中也发挥重要的作用，本研究所制备的单克隆抗体还可用于其他与DCP相关的研究。