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实验二淀粉酶活性的测定
预习报告
生物094左宇0902040409
一、研究背景：酶作为生物体内催化剂，测定其活力是非常有必要的。不同种类的酶的活力测定方法不同，我们将通过在细节设计上差异较大的酶活力测定方法的设计细节的分析和具体酶活测定操作，体会分析比较其设计细节的差异，从而获取相关设计理念并完成没活力测定实验操作的训练。

二、研究目标：按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数，来对这两种酶进行有效的测定。

三、研究策略：两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。

四、研究方案及可行性分析：两种酶作用淀粉的方式不同。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

五、具体实验设计
1、所需的主要材料、试剂、仪器
（1）实验材料：小麦种子
（2）实验仪器：离心机、离心管、研钵、电炉、容量瓶（50mL×1,100mL×1）、恒温水浴、分光光度计。
（3）实验试剂：1%淀粉溶液、pH5.6的柠檬缓冲液（A液、B液）、3,5-二硝基水杨酸溶液、麦芽糖标准液（1mg/ml）、0.4MNaOH。
2、具体操作步骤（单页流程图）
⑴样品制备：2克萌发的小麦种子→匀浆→少量多次用蒸馏水转移至50ml容量瓶约至40ml→浸提15-20分钟→定容→混匀→离心→取上清液备用（初始酶液）。
⑵α-淀粉酶活性的测定：试管4支（两只对照、两只测定）→加1毫升酶提取液→70℃恒温水浴加热15分钟→冰浴中冷却→各加入1mlpH5.6的柠檬缓冲液→40℃恒温水浴保温15分钟→两只对照管中各加入4ml0.4MNaOH→各管中加入40℃下预热的淀粉溶液2ml→摇匀→立即于40℃水浴中保温5分钟→两只测定管中分别迅速加入4ml0.4MNaOH→摇匀→准备下步糖的测定。
⑶α-淀粉酶和β-淀粉酶总活性的测定：取所制备的酶液5ml→放入100ml容量瓶中→用蒸馏水稀释至刻度→混合均匀→取4支试管（两只对照、两只测定）→加1毫升酶提取液→各加入1mlpH5.6的柠檬缓冲液→40℃恒温水浴保温15分钟→两只对照管中各加入4ml0.4MNaOH→各管中加入40℃下预热的淀粉溶液2ml→摇匀→立即于40℃水浴中保温5分钟→两只测定管中分别迅速加入4ml0.4MNaOH→摇匀→准备下步糖的测定。
⑷麦芽糖的测定：
标准曲线的制作
取7支干净的试管，按照表1操作。
表1标准液配方
管号1234567麦芽糖标准液（1mg/ml）00.10.30.50.70.91.0蒸馏水（ml）1.00.90.70.50.30.103,5-二硝基水杨酸（ml）1.01.01.01.01.01.01.0
摇匀→置沸水浴中煮沸5min→取出后流水冷却→加蒸馏水定容至15mL→在520nm波长下比色测定光密度（以1号管作为空白调零点）→绘制标准曲线（以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标）。
样品的测定
取8支干净的试管，按照表2操作。
表2待测液配方
管号89101112131415待测液（ml）实验步骤⑵中待测液各1mL实验步骤⑶中待测液各1mL3,5-二硝基水杨酸（ml）1.01.0
摇匀→置沸水浴中煮沸5min→取出后流水冷却→加蒸馏水定容至15mL→在520nm波长下比色测定光密度（以1号管作为空白调零点）→记录消光值→根据标准曲线，计算结果。

六、预习思考题
⒈酶活力测定实验的总体思路应该是什么？
答：没活力测定实验中都是根据酶活力的大小与催化产物的量成正比来计算酶活力大小的。

⒉由上述总体思路认为酶活力测定实验中最关键的设计应该是什么？为什么？在该项设计中要注意什么？
答：在酶活力测定实验中，最关键的有3点：测定酶促反应初速度、在最适条件下测定酶促反应速度以及底物浓度要远超酶量。因为在酶促反应初期，产物浓度随反应进程成