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实验24淀粉酶活性的测定

植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。植物中有α–淀粉酶和β–淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。通过本实验掌握淀粉酶的提取和测定方法。
一、原理
α–淀粉酶和β–淀粉酶，各有其一定的特性，如β–淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α–淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。将提取液加热到70℃维持15min以钝化β–淀粉酶，便可测定α–淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理，钝化α–淀粉酶，以求出β–淀粉酶的活性。
淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5–二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
萌发的小麦（芽长1cm左右）。
（二）试剂
1.1％淀粉：称取1.0g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。
2.0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至l000mL；B液：称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1000mL。取A液55mL与B液145mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。
3.3,5–二硝基水杨酸溶液：精确称取3,5–二硝基水杨酸1g溶于20mL2mol/L氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。
4.麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中，仔细移入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
（三）仪器设备
小台秤，研钵，容量瓶100mL，具塞刻度试管，试管，刻度吸管lmL2mL10mL，离心机，恒温水浴，分光光度计。
三、实验步骤
1.酶液的提取称取1.0g萌发的小麦种子，置研钵中加2mL蒸馏水和少量石英砂，研磨成匀浆后转入离心管中，用7mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入50mL容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上速淀粉酶原液5mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。
2．麦芽糖标准曲线制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表35–1加入试剂：

表35–1制作麦芽糖标准曲线配方表
试剂管号1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（mL）2.01.81.61.20.80.40麦芽糖含量（mg）00.20.40.81.21.62.03，5-二硝基水杨酸（mL）2222222
摇匀，置于沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3．酶活力的测定取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表35–2进行操作。

表35–2酶活力的测定配方表
操作项目管号Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅰ-3Ⅱ-1Ⅱ-2Ⅱ-3淀粉酶原液（mL）1.01.01.0000钝化β-淀粉酶置70℃水浴中15min，取出后在流水中冷却淀粉酶稀释液（mL）0001.01.01.0DNS试剂（mL）2.0002.000预保温40℃恒温水浴保温10min40℃1%淀粉溶液（mL）1.01.01.01.01.01.0保温40℃恒温水浴中准确保温5minDNS试剂（mL）02.02.002.02.0
摇匀，置于水浴中煮沸5min,取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。摇匀，在540nm波长下比色，记录光密度值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，用以表示酶活性。
四、结果计算
α–淀粉酶总活性[麦芽糖（mg）/(g·min)]
(α+β)–淀粉酶总活性[麦芽糖（mg）/(g·min)]
式中：A——α–淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（在标准曲线上查得值），mg。
A′——α–淀粉酶的对照管中麦芽糖量，mg。
B——(α+β)–淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量，mg。
B′——(α+β)–淀粉酶的对照管中麦芽糖量，mg。
V——测定时所用样品液体积，mL。
t——酶作用时间，min。

[思考题]
1.萌发种子和干种子的α-淀粉酶和β-淀粉酶活力有何差异？这种变化有何生物学意义？
2.α-淀粉酶和β-淀粉酶性质有何不同？作用特点有何不同？
3.实验重复设置Ⅰ-1、Ⅱ-