生物农药作业 路强.doc

苏云金芽孢杆菌的分离

路强
（园林工程学院10级生物技术及应用班）

摘要：为了得到苏云金芽孢杆菌的菌株，我们从锦带花根系表土下5~25cm取土作为分离样品通过富集培养、分离培养基筛选出目的菌株。
关键词：苏云金芽孢杆菌
苏云金芽孢杆菌是目前全世界公认的最有前途的生物农药,由于其较强的杀虫能力,且对目标外生物无不利影响,对生态环境不会造成污染,受到了各国的重视。但因其药效迟缓、使用量较大、价格偏高,作用不如化学防治速效,限制了它的推广和运用。目前各国生化学家通过研究增效剂来改善苏云金芽孢杆菌的杀虫性能,已取得了显著成效。﹝1﹞
1材料和方法
1.1材料
1.1.1土样
2012年6月4日下午从园林工程学院11号楼后花园里锦带花根系表土下5~25cm取土过80目筛。
1.1.2药品
BPA培养基、BP培养基、生理盐水等。
1.1.3耗材与设备
微电脑光照培养箱、手提式高压蒸汽灭菌器、天平、称量纸、电炉、药勺、吸水纸、量筒、量杯、烧杯、锥形瓶、铁架台、漏斗、胶皮管、线绳、棉花、纱布、玻璃棒、培养皿、洗耳球、试管、接种针、接种环、滴管、pH试纸（5~9）、电磁炉、铁缸、剪刀、插排、牛皮纸、纱布、水浴锅、1mL吸量管、纱布、95%的酒精、超净工作台、酒精灯、10mL吸量管等。
1.2方法
1.2.1富集培养
称取1g土样于超净工作台中倒入灭菌后的盛有50mLBPA培养基的三角瓶中（有2瓶加庆大霉素处理），然后用牛皮纸包扎好放入培养箱中30℃黑暗培养1~2d。
表1BPA培养基成分质量或体积实际称量蛋白胨（peptone）10g2g牛肉膏（beefextract）5g1g醋酸钠（sodiumacetate）34g6.8g加纯净水至1000mL200mLpH值7.0~7.2上述培养基的配制：准确称取蛋白胨2g、牛肉膏1g、醋酸钠6.8g溶解在装有适量纯净水的烧杯中溶解，转入合适的量杯中定容至200mL。然后分装于4个100mL的三角瓶中。塞好棉塞，用牛皮纸和线绳捆扎好，灭菌：加水→装锅→加热排气（0.05MPa，2次）→升压保压灭菌（0.1Mpa，121.5℃，20~30min）→降压出锅→冷却（下面灭菌过程相同）。
1.2.2分离
先取出富集培养的三角瓶于70~75℃水浴中保温15min，后取出冷却。再用75%酒精表面消毒拿入准备好的超净工作台，先把灭过菌的试管摆放在试管架上（在试管上分别用玻璃笔或记号笔标好10-1、10-2、10-2、10-4、10-5、10-6）且每管加9mL无菌生理盐水（使用10mL吸量管移取）。再用灼烧后的1mL的吸量管吸1mL富集液于9mL的生理盐水中，充分混匀，制成10-1的土样匀液；用过的吸量管管用酒精灯火焰灼烧灭菌后放在搁架（无菌的）上，依次完成梯度稀释。然后依次从每个梯度中用1mL的吸量管吸0.2mL菌液（吸前要摇匀）于BP培养琼脂平板上用涂布器涂匀，用胶带纸封口。每个梯度涂2个板。用牛皮纸包扎好于培养架上室温培养1~2d。
表2BP培养基成分质量或体积实际称量牛肉膏（beefextract）5g5g蛋白胨（peptone）10g10g氯化钠5g5g琼脂10~15g11g加纯净水至1000mL1000mLpH值7.0~7.2配制：准确称取蛋白胨5g、牛肉膏10g、氯化钠5g溶解在装有适量纯净水的烧杯中溶解，转入溶有琼脂的量杯中定容至1000mL；后用pH试纸测试培养基的pH值，如不符合要求，可用1mol/L的NaOH或1mol/LHCl进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。然后分装于6个250mL的三角瓶中。塞好棉塞，用牛皮纸和线绳捆扎好，灭菌。出锅后在超净工作台上倒平板。
表3生理盐水的配制成分质量或体积实际称量氯化钠8.5g1.7g蒸馏水1000mL200mL准确称取氯化钠溶解在装有适量纯净水的烧杯中溶解，转入合适的量杯中定容；然后用玻璃棒引流分装入锥形瓶中，体积不超过容量瓶体积的2/3。塞好棉塞，用牛皮纸和线绳捆扎好，灭菌。
1.2.3纯化
取出长有疑似苏云金芽孢杆菌单菌落的BP琼脂平板于超净工作台上，用无菌接种针或接种环稍蹭一下疑似的单菌落然后在新的平板上划线并做好标记，也接BP试管斜面几支管包扎好放于培养架上室温培养。
培养基同表2
2结果与分析
2.1培养特性

图1土样中细菌的富集2.1.1富集培养
所取土样在BPA培养基在培养箱培养2d后，土样中的细菌都繁殖起来，培养基表面出现粘稠状液体，培养基整体颜色变深如图1所示。
2.1.2分离
在分离时，先对富集后的菌液进行70~75℃水浴中保温15min处理，然后经过涂布培养，我们得到了长有疑似芽孢杆菌的平板；有的平板疑似菌落连在一起如图2所示，有的平板上的疑似菌落产色素的，也有的板上长有典型的疑似目的菌