蛋白质分离纯化ppt课件.ppt

蛋白质分离纯化蛋白质的分离纯化样品的前处理蛋白质的分离方法根据蛋白质的溶解度差异分离—沉淀技术
可逆沉淀：
等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀
不可逆沉淀：
热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀1、根据溶解度不同（2）等电点沉淀法1）pH偏离pI时，蛋白质带相同符号的净电荷而互相排斥→蛋白质溶解度大。2）pH=pI时，蛋白质的净电荷为0→蛋白质聚集沉淀3）等电点沉淀法的缺点：沉淀不完全。2、根据分子大小不同透析——只用于除盐类和小分子杂质透析——只用于除盐类和小分子杂质2）超滤（ultrafiltration）：是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。Ultrafiltration的功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙二醇）。Ultrafiltration膜：丙烯氰、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等。超过滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质（2）凝胶层析原理：
1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物质迁移速度快；
2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，所以小分子物质迁移速度慢。....（3）密度梯度离心密度梯度离心3、根据带电性质不同（1）电泳法垂直板电泳垂直板电泳垂直板电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳在浓缩胶中的三个主要作用角色：浓缩效应：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦（Isoelectricfocusing）等电聚焦（Isoelectricfocusing）等电聚焦（Isoelectricfocusing）.等电聚焦（Isoelectricfocusing）（2）离子交换层析离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。离子交换层析.离子交换层析4、根据配体特异性不同亲和层析的基本原理：生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。
亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose－4B等。
将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。..小结蛋白质分子中氨基酸序列的确定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定氨基酸平均分子量为128，测得某蛋白质分子量约为5646.由此推断该蛋白质含有的肽链条数和氨基酸个数依次是？测定步骤
1多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。
2测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
3二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。4测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目
用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水