阿尔法淀粉酶产生菌的筛选.pdf

实验7-1α-淀粉酶产生菌的筛选

1目的要求

掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种产酶微生物的完整操作步骤。

2实验原理

α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶它的产生菌广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质
的土壤等样品中。本实验利用淀粉与碘的显色反应，采用变色圈法筛选α-淀粉酶的产生菌。

3实验器材

3.1实验材料
（1）分离培养基（g/L）
蛋白胨10，NaCl5，牛肉膏5，可溶性淀粉2，琼脂15，pH7.2。
需注意的是先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状，再加到溶化好的培养基中，调
匀。
（2）麸曲培养基

麸皮7g，玉米面1g，（NH4)2SO40.04g（4%（NH4)2SO4加1mL）；NaOH0.08g（8%NaOH
加lmL），水10mL，混合均匀，装入250mL三角瓶中，121℃灭菌30min。
3.2试剂
（1）Lugol氏碘液：碘1g，碘化钾2g，水300mL。配制时先将碘化钾溶于5～10mL
水中，再加入碘，溶解后定容。
（2）碘原液：碘2.2%，碘化钾0.4%，加水定容。
（3）标准稀碘液：取碘原液15mL，加碘化钾8g，水定容至200mL。
（4）比色稀碘液：取原碘液2mL，加碘化钾20mg，定容至500mL。
（5）0.2%可溶性淀粉液：称取0.2g可溶性淀粉，先以少许蒸馏水混合，再徐徐倾入煮
沸蒸馏水中，继续煮沸2min，冷却，加水至100mL。

（6）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液pH6.0：称取Na2HPO4•12H2O11.31g，柠檬酸2.02g，
加水定容至250mL。
（7）标准糊精液：称取0.3g糊精，悬浮于少量水中，再倾入400mL沸水中，冷却后，
加水稀释至500mL。冰箱存放。
3.3实验仪器
小铁铲和无菌纸或袋，无菌水三角瓶（300mL的瓶装水至99mL，内有玻璃珠若干），
无菌吸管（1mL、5mL等），无菌水试管（每支4.5mL水），无菌培养皿。

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4实验步骤

4.1分离纯化
（1）采集土样。
（2）样品稀释
在无菌纸上称取样品1g，放入100mL无菌水的三角瓶中，手摇10min。80℃水浴15min，
冷却。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中，梯度稀释至10-6。
（3）分离
用稀释样品的同支吸管分别依次从10-6、10-5、10-4样品稀释液中，吸取lmL，注入无菌
培养皿中，然后倒入灭菌并熔化冷至50℃左右的固体培养基，小心摇动冷凝后，倒置于35℃
温箱中培养48h。
（4）检查
培养48h后，取出平板，将皿中注入l滴Lugol氏碘液，因淀粉遇碘变蓝色，如菌落周围
有无色圈，则说明该菌能分解淀粉。
（5）纯化
从平板上选取淀粉水解圈直径与菌落直径之比较大的菌落，用接种环沾取少量培养物至斜
面上，并进行2～3次划线分离，挑取单菌落至斜面上，培养后观察菌苔生长情况并镜检验证
为纯培养。
4.2麸曲培养
取纯化菌落斜面中加入5mL无菌水制成菌悬液，取2mL接种至麸曲培养基中，搅均后，
36℃培养24h。
4.3实验分析项目和方法
4.3.1制备酶液
在已成熟的麸曲三角瓶中，加水100mL，搅匀，置于30℃水浴中30min，用滤纸过滤，
滤液即细菌α-淀粉酶液，待测。
4.3.2α-淀粉酶活力的测定（参见实验3-5）

5实验结果

在详细记录实验数据的基础上完成实验报告。

6思考题

（1）α-淀粉酶的催化特性？
（2）筛选α-淀粉酶产生菌时应如何选择采样地点？

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