BCA法测蛋白浓度.doc

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【目的】：掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。
【原理】：
BCA(bicinchoninincacid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+复原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
【操作】
标准曲线的绘制：取试管七支、编号，按下表操作：
【计算】
〔一〕绘制标准曲线。
〔二〕以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
〔三〕再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。
【优缺点】(一)操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。(三)经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；(四)抗试剂干扰能力比拟强，如去垢剂，尿素等均无影响
【器材】〔一〕7220型分光光度计〔二〕恒温水浴箱〔三〕中试管7支〔四〕枪式移液管【试剂】1、试剂A：1％BCA二钠盐2％无水碳酸钠0.16%酒石酸钠0.4％氢氧化钠0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25。2、试剂B：4％硫酸铜。3、BCA工作液：试剂A100ml＋试剂B2ml混合。4、蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。〔纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定〕5、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。