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p53基因克隆表达及其活性测定的中期报告
中期报告
一、研究背景
p53基因是人体细胞生长和凋亡调节的重要基因，也被称为肿瘤抑制基因。其在细胞内的主要作用是监控细胞的DNA损伤情况，以及其他细胞生长和凋亡的相关信号，并调控细胞的生长和凋亡决策。同时，在一些恶性肿瘤中，p53基因突变或缺失会导致恶性细胞的过度生长和扩散，从而促进肿瘤的形成和发展。因此，研究p53基因的克隆和表达，以及其活性的测定，在理论研究和临床治疗上都具有重要的意义。
二、研究方法
本研究通过RT-PCR技术，从人类瘤细胞系中克隆出p53基因的全长cDNA序列，并将其插入pET28a表达载体中。通过大肠杆菌的表达宿主菌BL21(DE3)进行诱导表达，并用Ni-NTA亲和层析纯化p53基因蛋白。在免疫印迹法检测纯化后的p53蛋白的同时，将采用p53靶基因P21WAF1/CIP1的表达来进一步检测p53蛋白的活性。
三、研究结果
1.p53基因克隆和表达：
通过RT-PCR技术，成功从人类瘤细胞中放大了p53基因的全长cDNA序列。将此序列成功地插入到pET28a表达载体中，并转入BL21(DE3)大肠杆菌中，进行IPTG诱导表达。利用Ni-NTA亲和层析纯化纯度良好的p53基因蛋白。
2.纯化后的p53蛋白鉴定
利用免疫印迹法检测纯化后的p53蛋白，发现得到的蛋白质量接近于预期，表明克隆和纯化过程都取得了较好的成功。
3.活性测定：
通过免疫印迹检测p53靶基因p21WAF1/CIP1的表达，发现在p53蛋白的诱导下，p21WAF1/CIP1的表达明显增加，表明p53蛋白具有较好的活性。
四、研究结论
通过此次克隆和表达p53基因，以及对p53蛋白的活性测定，能够进一步深入理解p53基因在生物过程中的功能，并为临床治疗中肿瘤抑制剂的开发提供了基础。