CRISPRCas9介导MSTN基因敲除绵羊制备的任务书.docx

CRISPRCas9介导MSTN基因敲除绵羊制备的任务书
任务书
一、任务背景
MSTN基因编码肌肉生长抑制因子（myostatin）。MSTN基因敲除可以引起绵羊体重的增加和更快的肌肉生长。利用CRISPR/Cas9技术对MSTN基因进行敲除，可以制备出肌肉更发达、体重更高的绵羊品种，从而为畜牧业的发展提供新的技术手段。
二、研究内容
1.熟悉CRISPR/Cas9技术原理和方法，查阅相关资料，确定设计MSTN基因敲除的gRNA序列。
2.利用构建好的gRNA载体通过电穿孔等方法转染到绵羊成纤维细胞中，对细胞进行筛选，获得含MSTN基因二个可敲除的单倍体细胞，并进行PCR鉴定。
3.将筛选好的单倍体细胞进行诱导倍性并进行培养，得到含有敲除MSTN基因的四倍体细胞，并进行PCR和Westernblot等鉴定，确保MSTN基因已经被敲除。
4.选取得到MSTN基因敲除的四倍体细胞，进行体外胚胎发育，嵌合到公羊的卵母细胞中，经过体外培养和转移后，产出MSTN基因敲除的绵羊胚胎。
5.将产出的MSTN基因敲除的绵羊胚胎植入到母羊的子宫内，进行孕育，生育出MSTN基因敲除的绵羊，并进行PCR和Westernblot等鉴定。
三、实验步骤
1.筛选gRNA序列，对gRNA序列进行分析和评估，确定最佳的gRNA。
2.通过电穿孔等方法将gRNA载体转化到绵羊成纤维细胞中，用BLAST检测，获取含可敲除的MSTN基因的细胞，并进行PCR鉴定。
3.将含可敲除的单倍体细胞进行诱导倍性，得到含敲除MSTN基因的四倍体细胞，并进行PCR和Westernblot等鉴定。
4.选取得到MSTN基因敲除的四倍体细胞，进行体外胚胎发育，嵌合到公羊的卵母细胞中，经过体外培养和转移后，产出MSTN基因敲除的绵羊胚胎。
5.将产出的MSTN基因敲除的绵羊胚胎植入到母羊的子宫内，进行孕育，生育出MSTN基因敲除的绵羊，并进行PCR和Westernblot等鉴定。
四、实验条件与要求
实验室：设备齐全、条件优良的CRISPR/Cas9实验室。
基础设施：实验室应具有必要的基础设施，包括生物安全柜、PCR仪、离心机、超速离心机、电导仪、色谱仪、显微镜、培养箱等设备。
人员：具备较高的实验动手能力、生物学实验知识和相关经验。
五、参考文献
1.MuTuPe蚕宝基因组学团队.论文研究中的CRISPR-Cas9技术的应用[J].新技术新成果,2019(06):148-148.
2.杨娟娟,严晓芳,闫华丽.基于CRISPR/Cas9技术的猪细胞系构建[J].安徽农业科学,2020,48(05):195-199.
3.冯稳.CRISPR技术在绵羊基因编辑中的应用[J].林业经济,2019,41(07):130-131.
4.朱凤敏.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术研究鸡CCL19的功能及其调控作用[D].中国农业大学学位论文,2016.
六、预期成果
1.成功构建含敲除MSTN基因的细胞系。
2.实现MSTN基因的敲除，并证明细胞系的MSTN基因敲除的有效性。3.成功获得MSTN基因敲除的绵羊，并鉴定绵羊的体重和肌肉发达程度。