乳酸发酵与乳酸菌饮料的制作.doc

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山东理工大学乳酸发酵与乳酸菌饮料的制作

学院：生命科学学院
班级：生物工程0901班
成员：张强（0911071008）
张志豪（0911071010）
李桂军（0911071022）
乳酸发酵与乳酸菌饮料的制作
摘要：取适量新鲜酸乳稀释后接入BCG牛乳培养基，选取圆形稍扁平的黄色菌落，初步定位乳酸菌。选取典型菌落转至脱脂乳试管中培养并观察是否出现凝乳现象，并从能够凝乳，无气泡，呈酸性的试管中挑取样品涂片镜检，进行革兰氏染色，确定为乳酸菌后传代培养，选出菌种进行乳酸发酵及检测。再利用市售新鲜酸乳为发酵剂接入制作饮料的培养基质，制作乳酸菌饮料。
关键词：酸乳乳酸菌分离纯化乳酸发酵酸碱滴定
引言：许多种类的微生物（主要是细菌）在厌氧条件下分解己糖产生乳酸的作用称为乳酸发酵。能利用可发酵糖产生乳酸的细菌称为乳酸细菌。乳酸细菌多是兼性厌氧菌，在厌氧条件下经过EMP途径，发酵己糖进行乳酸发酵。生活中酸乳中常见的乳酸菌有保加利亚杆菌和嗜热链球菌等。酸乳是一种常见的乳酸饮料，它是以牛乳为主要原料，加入一定的糖类，接入一定量的乳酸菌，经过发酵后而制成的饮料。本次实验的目的是学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。
1.乳酸菌的分离纯化
1.1乳酸菌的分离
1.1.1BCG牛乳培养基的配制
BCG牛乳培养基的制备比例见下（100mL）：
A溶液：脱脂乳粉20g水100mL
1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇0.2mL
B溶液：酵母膏2g水100mL
琼脂4g其中A溶液80℃灭菌20min，B溶液调pH6.8，121℃湿热灭菌15min，无菌混合倒平板。
1.1.2梯度稀释（无菌操作）
所需仪器：试管（7支）、移液器、枪头。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头
用量程为1000µL的移液管从市售新鲜酸乳中吸取1ml酸乳加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的酸乳稀释液。
1.1.3涂布平板
将释倍数分别为10-4、10-5、10-6的样品溶液涂布到BCG牛乳培养基上，37.5℃培养48h。选取圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定位乳酸菌。
1.2乳酸菌的鉴别与传代培养
1.2.1脱脂乳试管的制备
直接选用脱脂乳粉与5%蔗糖水为1:10比例配制，装量为试管的1/3，115℃灭菌15min备用。
1.2.2乳酸菌的鉴别
选取选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落，用接种环挑取转至脱脂乳试管中，37.5℃培养箱中培养8~24h，观察其中牛乳是否出现凝固。
1.2.3乳酸菌的传代培养
选取上述步骤中的乳酸菌，接入脱脂乳试管中，连续传代培养4~6次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作为菌种待用。
2.乳酸发酵及检测
2.1乳酸的发酵
2.1.1乳酸菌培养液的制备
乳酸菌培养液的制备比例见下：
牛肉膏5g酵母膏5g
蛋白胨10g葡萄糖10g
乳糖5g水1000mL按照以上比例配制600mL培养液，调pH至6.8，121℃灭菌20min。
2.1.2乳酸菌的接种与培养
在无菌操作下将分离的一株乳酸菌接种于装有300mL乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，置于37.5℃静止培养。2.2乳酸发酵的检测
为了便于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每6~8h取样分析，测定pH。另一组在接种培养24h后每瓶加入CaCO32.5g（以防止发酵液过酸使菌种死亡），每6~8h取样，测定乳酸含量（酸碱滴定法），记录测定结果。
3.乳酸菌饮料的制作
3.1乳酸菌培养基的制作
将脱脂乳和水以1:7（W/V）的比例，同时加入6%的蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。此外还选取了市售纯牛奶作为另一种培养基质使用。
3.2接种
以市售新鲜酸乳为发酵剂，以2%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液。接种后摇匀，分装到以灭菌的三角瓶中，重复分装3瓶，随后将三角瓶密封。
3.3发酵
将接种后的酸乳瓶置40～42℃培养箱中培养3～4h时。培养时注意观察，出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃冰箱中冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸度适中（pH4～4.5）,凝块均匀致密,无乳清析出,无汽泡,获得较好口感和特有风味。
4.结果与分析
4.1乳酸菌的分离
我们蘸取为10-4、10-5、10-6三个稀释度接种到六个培养基培养后，有三个培养基上长出少量黄色菌落（图1），初步鉴定为乳酸菌落；

图1
4.2乳酸菌的鉴别
选取牛乳出现凝固，无汽泡，呈