29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108504749A(43)申请公布日2018.09.07(21)申请号201810336988.7(22)申请日2018.04.16(71)申请人南京医科大学地址211166江苏省南京市江宁区龙眠大道101号(72)发明人陈峰陈鹏李开黄惠结俞延芳俞尤嘉毛征生(74)专利代理机构北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙)11531代理人李宏伟(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书3页说明书11页序列表10页附图7页(54)发明名称29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用(57)摘要本发明公开了一种29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用。本发明通过获取群体数据，再从中获取微单倍型基因型、等位基因频率，计算出候选位点在不同人群中的法医学相关参数，再将影响后续测序分型的位点进行排除后，得到29个微单倍型位点；根据该29个微单倍型位点设计引物、扩增条件并建立三轮PCR扩增体系为基础的复合扩增体系，该复合扩增体系对混合生物检材中提取到的DNA模板进行扩增，并将扩增结果进行大规模并行测序，获得各微单倍型位点在DNA模板中测序深度的数值，最终达到对混合生物检材的分型目的。本发明复合扩增体系适用于大规模并行测序技术，具有检测通量高、检测速度快、获得数据量大、检测结果更准确等优势。CN108504749ACN108504749A权利要求书1/3页1.一种29个微单倍型位点，其特征在于，该29个微单倍型位点具体为：2.权利要求1所述的29个微单倍型位点的筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)从千人基因组数据库中获取的群体数据；(2)根据筛选规则从所述群体数据中获取微单倍型基因型、等位基因频率，并计算出候选位点在不同人群中的法医学相关参数的详细过程；(3)对筛选出的微单倍型位点所在的序列作进一步检查，并将影响后续测序分型的位点进行排除。3.如权利要求2所述的29个微单倍型位点的筛选方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述筛选规则为序列长度小于50bp，具有4个或以上等位基因，且至少4个等位基因频率大于0.1，在中国汉族人群中Ae值大于3。4.如权利要求2所述的29个微单倍型位点的筛选方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述排除影响后续测序分型的位点包括：二核苷酸多态、连续的重复序列以及连续多个相同碱基。5.权利要求1所述的29个微单倍型位点的复合扩增体系，其特征在于，该扩增体系包括：(1)第一轮PCR扩增体系2CN108504749A权利要求书2/3页该第一轮PCR扩增体系以DNA模板为目标进行扩增，体系中的引物分别根据所筛选出的各微单倍型位点进行设计，该第一轮PCR扩增体系中还包括搭桥序列；(2)第二轮PCR扩增体系该第二轮PCR扩增体系以第一轮扩增产物的稀释液为模板进行第二轮扩增；(3)第三轮PCR扩增体系该第三轮PCR扩增体系以第二轮PCR扩增产物为模板进行第三轮扩增，第三轮PCR扩增体系中所用引物为“标签序列+barcode序列+搭桥序列”的互补序列。6.如权利要求5所述的复合扩增体系，其特征在于，所述第一轮PCR扩增体系中，与29个微单倍型位点分别对应的引物具体为：。7.如权利要求6所述的复合扩增体系，其特征在于，所述搭桥序列具体为：前扩增引物：5’-ACGACGTGTCGAGTTCAGG+，后扩增引物：5’-CAGTGAGTCGCCACAGGTCA+；在所述第三轮PCR扩增体系中，所述标签序列和barcode序列根据使用者选用的不同大规模并行测序平台进行个性化设计。8.权利要求5所述的复合扩增体系在混合生物检材的检验分型方面的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述混合生物检材为中国人群的混合生物检材。3CN108504749A权利要求书3/3页10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，该应用的方法包括以下步骤：(1)将混合生物检材中提取到的DNA模板分别经过多微单倍型位点复合扩增体系中的第一轮PCR扩增体系、第二轮PCR扩增体系、第三轮PCR扩增体系扩增；(2)将经过多微单倍型位点复合扩增体系的最终扩增结果进行大规模并行测序，获得各微单倍型位点在DNA模板中测序深度的平均值。4CN108504749A说明书1/11页29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用技术领域[0001]本发明属于法医物证鉴定，尤其涉及一种29个微单倍型位点、筛选方法、复合扩增体系及应用。背景技术[0002]混合生物检材是指由两个或多个生物学成分混杂在一起的检材。混合生物检材是法医学实际检案中较为常见的一类疑难检材。随着科学技术手段的不断进步，越来越多的刑事案件加入了对混合生物检材中