一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110170048A(43)申请公布日2019.08.27(21)申请号201910445069.8A61P31/14(2006.01)(22)申请日2019.05.27C12N7/00(2006.01)(71)申请人北京智飞绿竹生物制药有限公司地址100176北京市大兴区经济技术开发区同济北路22号申请人重庆智飞生物制品股份有限公司安徽智飞龙科马生物制药有限公司(72)发明人张立杰宋菲菲马莹麻宏贺王凤伟(74)专利代理机构北京华科联合专利事务所(普通合伙)11130代理人王为孟旭(51)Int.Cl.A61K39/15(2006.01)A61K39/39(2006.01)权利要求书2页说明书13页附图2页(54)发明名称一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法(57)摘要本发明涉及一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法，所述方法步骤如下：1)生产细胞复苏，细胞增殖培养；2)扩增培养；3)加入细胞生长液，细胞使用胰酶进行消化，平行培养；4)细胞表面清洗；5)利用胰酶对于即将接种轮状病毒进行活化；6)将活化的轮状病毒接种到生产细胞，添加培养基培养；7)收获病毒液，离心，取上清液；8)超滤浓缩；9)层析，离子交换；10)甲醛灭活；11)添加氢氧化铝佐剂配制疫苗。CN110170048ACN110170048A权利要求书1/2页1.一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)生产细胞复苏，在方瓶、转瓶进行细胞增殖培养；2)将传代的生产细胞从转瓶中消化后，接至生物反应器中，利用微载体进行扩增培养；3)转接之前，将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，将反应器调置合适参数运转；3)细胞使用胰酶进行消化，进行逐级放大方式，如10L～40L～70L～150L，或采用10L～40L～70L逐级放大，之后平行3～4个70L进行平行培养；4)接种病毒前对于微载体细胞用无血清培养基通过灌流方式进行细胞表面清洗；5)利用一定浓度的胰酶对于即将接种轮状病毒进行活化；6)将活化的轮状病毒接种到清洗后的生产细胞，孵育吸附后，添加培养基培养；7)培养3-5d，收获病毒液，反复冻融三次，离心去处微载体，取上清液；8)对上清液进行超滤浓缩；9)利用Core700填料进行层析，之后利用QFF进行离子交换，以达到去除杂蛋白的纯化效果；10)将层析收获液经一定比例甲醛灭活4-6天后，除去甲醛；11)添加氢氧化铝佐剂配制疫苗。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：病毒的接种量为0.001～0.1MOI。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：病毒活化方法是5～20μg/ml0.25％胰蛋白酶，37℃水浴，0.5～1小时，活化后接种轮状病毒并吸附1～2小时，吸附液所需0.25％胰蛋白酶浓度是5～20μg/ml，病毒维持液所需0.25％胰蛋白酶浓度是10～40μg/ml，由于轮状病毒的特性，在反应器微载体接种病毒的过程中的活化、吸附和维持阶段都需要加入0.25％胰蛋白酶、CaCl2，用以激活轮状病毒，所以反应器接毒的时候应尽量除去血清，以免影响胰蛋白酶活性。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex1，微载体的密度为10～20g/L。5.根据权利要求1～4所述的方法，其特征在于：生物反应器的细胞培养采用灌流培养的方式，灌流的速率根据细胞的密度为每天0.5～4个工作体积，接种病毒后停止灌流直至收获病毒液。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的澄清的轮状病毒收获液经截流分子量为300～500KD的切向流系统进行超滤浓缩5～10倍，得到病毒浓缩液。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：轮状病毒浓缩液，通过装填有新型复合填料CaptoCore700的层析柱内，收集流穿峰。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：得到的轮状病毒通过加入装填有QSepharoseFastFlow填料的层析柱内，收集第一个洗脱峰，此峰为目的蛋白峰。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对得到的抗原蛋白进行甲醛灭活，按甲醛溶液：样品(V/V)＝1:1600～1：800的比例加入甲醛溶液，置于双层振荡培养箱内，温度：37℃，转速：110rpm，灭活2-6天。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将纯化的灭活病毒与佐剂混合免疫试验小鼠，采集动物血清，用ELISA方法检测来轮状病毒特异性中和抗体，对于不同轮状病毒毒2CN110170048A权利要求书2/2页株(G1、G2、G3、G4、G6、G9)中和滴度最高可达16384，最低达到1：2024。3CN110170048A说明书1/13页一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法技术领域[0001]本发明涉及疫苗的制备，特别涉及轮状病