一种miRNA-21的检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110387401A(43)申请公布日2019.10.29(21)申请号201910653576.0(22)申请日2019.07.18(71)申请人中国药科大学地址211198江苏省南京市江宁区龙眠大道639号(72)发明人余伯阳田蒋为黄浠桐(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人柏尚春(51)Int.Cl.C12Q1/682(2018.01)C12Q1/54(2006.01)C12Q1/44(2006.01)C12Q1/34(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图3页(54)发明名称一种miRNA-21的检测方法(57)摘要本发明公开了一种miRNA-21的检测方法，该方法在磁珠上偶联底物链-蔗糖酶复合物，当靶标miRNA出现后与底物链杂交，双链特异性核酸酶能选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的活性，释放的miRNA进行下一轮杂交循环；最后上清液中的蔗糖酶将蔗糖水解为葡萄糖，通过血糖仪检测获得输出信号。本发明通过引入双链特异性核酸酶和蔗糖酶对miRNA的检测信号进行双酶放大作用，提高了检测灵敏度，在10-200pM具有线性关系，检测限为1.8pM，具有简便、快捷、灵敏、高效等优点。CN110387401ACN110387401A权利要求书1/1页1.一种miRNA-21的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接底物链(SEQIDNO.1)-蔗糖酶复合物，形成检测探针；所述底物链的结构为5’-生物素-自由链片段1-杂交片段-自由链片段2-3’；所述自由链片段1的序列为：5’-aaaaa-3’；自由链片段2的序列为：5’-aaaaaaaaaa-3’；杂交片段的序列为：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；(2)检测探针弃去澄清溶液后加入待检测miRNA-21(SEQIDNO.2)、DEPC处理水、双链特异性核酸酶缓冲液和DSN，进行反应，待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，之后进入下一轮杂交循环；(3)将反应溶液进行磁分离，然后将澄清的上清液转移到含有缓冲液A的蔗糖溶液中，进行反应；(4)检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。2.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的双链特异性核酸酶缓冲液包含50mMTris-HCl，5mMMgCl2和1mMDTT和1μLDSN(1U/uL)，pH值8.0。3.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号。4.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述检测探针的制备方法为：(1)制备底物链溶液：用DEPC水配制底物链，加入磷酸钠缓冲液和溶解在DEPC水中的TCEP，将混合物在室温下静置后超滤纯化；(2)制备纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用缓冲液A配制蔗糖酶溶液，与sulfo-SMCC混合；涡旋后，于室温条件置于振荡器上反应，离心除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化；(3)制备底物链-蔗糖酶复合物：将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置；然后使用缓冲液A、超滤纯化除去未反应的底物链；(4)将底物链-蔗糖酶复合物和链霉亲和素修饰磁珠偶联：向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应，最后，用缓冲液B洗涤除去未连接的DNA链。5.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中miRNA与葡萄糖浓度的线性关系为：当miRNA-21浓度在10-200pM范围内符合线性方程y＝2.98+0.12x，其中，y为血糖仪读数，x为miRNA-21浓度。6.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)缓冲液A中含有氯化钠和磷酸钠，pH值7.3。2CN110387401A说明书1/6页一种miRNA-21的检测方法技术领域[0001]本发明涉及微小RNA的检测方法，特别涉及一种miRNA-21的检测方法。背景技术[0002]microRNAs(miRNAs)是一类长约18-25nt的内源性非编码小分子，存在于血清、血浆或尿液等体液中，它通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，在翻译水平上调控后基因的表达。因此，miRNAs参与生物体多种生理过程，控制细胞分化、增殖和凋亡。然而，由于