荧光定量PCR步骤.doc

荧光定量PCR步骤
荧光定量PCR步骤
荧光定量PCR步骤
2。3。2反转录反应
2.3.2.1去除基因组DNA反应
按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
试剂使用量5×gDNAEraserBμffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA1μgRNaseFreedH2Oμpto10μl42℃水浴2min，冰上放置.
2.3。2.2反转录反应
反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制MasterMix，然后再分装10μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。
试剂使用量步骤1的反应液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix1.0μl5×PrimeScriptBμffer24.0μlRNaseFreedH2O4.0μlTotal20μl
PCR反应程序，37℃15min,85℃5sec，4℃保温后。用核酸检测仪检测cDNA浓度，保存于-20℃.

2。3.3.2RealTimePCR
应用ThermalCyclerDiceRealTimeSystem扩增仪的操作方法
按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂使用量SYBR®PremixExTaqII10μlPCRForwardPrimer0.8μlPCRReversePrimer0。8μlRT反应液Rox0。4μldH2O（灭菌蒸馏水）6μlTotal20μi2）进行RealTimePCR反应.
采用两步法PCR反应程序
Stage1：预变性
Repeat:1
95℃30秒
Stage2：PCR反应
Repeat：40
95℃5秒
60℃30—60秒