实时荧光定量PCR具体实验步骤.doc

实时荧光定量PCR具体实验步骤————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：个人收集整理勿做商业用途个人收集整理勿做商业用途个人收集整理勿做商业用途实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟.4℃下12000rpm离心15分钟.离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中.水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％.③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中.加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀.混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5—10分钟。⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用.2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100）后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。①浓度测定A260下读值为1表示40µgRNA/ml.样品RNA浓度（µg/ml）计算公式为：A260×稀释倍数×40µg/ml。具体计算如下:RNA溶于40µlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260=0.21RNA浓度=0。21×100×40µg/ml=840µg/ml或0。84µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35µl，剩余RNA总量为：35µl×0.84µg/µl=29。4µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2。1.2）变性琼脂糖凝胶电泳测定①制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12。3M).10×MOPS电泳缓冲液浓度成分0。4MMOPS，pH7。00.1M乙酸钠0.01MEDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25µl溶液.胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。②准备RNA样品取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml.加热至70℃孵育15分钟使样品变性.③电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm.④紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2μl2上游引物0。2μl3下游引物0.2μl4dNTP0.1μl5逆转录酶MMLV0。5μl6DEPC水5μl7RNA模版2μl8总体积10μl轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0。5μl，37℃水浴60分钟。③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于—80℃待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β—actin）实时定量PCR①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。②反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBRGreen1染料10μl2