DNA重组克隆的单元操作课程.pptx

第二节工具酶
（一）基本知识RE将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。3.性质:内切酶,在核酸分子链的内部制造切口的酶。4.功能:自我保护作用I型限制性内切酶首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（2）识别位点序列需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。类型Ⅰ：大型的多亚基的蛋白质。
具有内切酶的活性、
具有甲基活性化酶的活性。
具限制和修饰两种体系，
切割位点基本上是随机。

因此Ⅰ型内切酶在DNA重组研究工作中并没有什实际用处。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（2）识别位点序列EcoRI5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’

PstI5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’

产生粘性末端（4）粘性末端①连接便利③补平成平齐末端识别位点和切点完全相同称同裂酶。XmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
SmaI5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’（6）II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：3.III类限制性内切酶1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：4.限制酶前面要带上R（Restriction)，
修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。限制性核酸内切酶的命名DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。是影响限制酶活性的重要因素。温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。EcoRI和BamHI等都有*活性。EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。
（五）限制性内切酶对DNA的消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。只有有限数量的酶切位点被切开。大多数酶可用65oC温育5分钟失活。
或用乙醇沉淀DNA。（一）功能：在大肠杆菌中大多数都有如下位点特异的甲基化酶。（三）甲基化对限制酶切的影响三、DNA连接酶(DNAligase)OHP2、种类1)修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。2)修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键Tris-HCl（1）必须是两条双链DNA。
不能催化两单链DNA分子连接；
只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick)；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺(gap)。DNAligase的活性（2）DNA3’端有游离的-OH，
5’端有一个磷酸基团（P）。连接酶反应的最佳温度是37C。（一）基因工程中常用的DNA聚合酶：
大肠杆菌DNA聚合酶
2.Klenowfragment
3.T4噬菌体DNA聚合酶
4.T7噬菌体DNA聚合酶
5.耐热DNA聚合酶
6.反转录酶
7.末端转移酶1.共同特点（三）DNA聚合酶在基因工程中的用途标记标记③DNA聚合酶I对探针序列的标记5’3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。纯化的DNA片段2.Klenowfragment①3’端补平③cDNA第二链的合成（1）T4DNA聚合酶的性质③特点（2）T4DNA聚合酶的用途酶切中间产生两个末端标记4.T7DNA聚合酶（2）T7DNA聚合酶的特点②进行末端标记5.耐热DNA聚合酶6.逆转录酶（3）逆转录酶的用途7.末端转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）TdT的基本特性：五、T4多核苷酸激酶3.多核苷酸激酶的用途六、碱性磷酸酶2.碱性磷酸酶的特性七、核酸酶2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）3、单链核酸内切酶：S1核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶4、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶2、双链核酸外切酶：
l核酸外切酶（lExo）a.放射性标记的优缺点：b.非放射性标记纯化的DNA片断演讲完毕，谢谢观看！