同工酶凝胶电泳.ppt

三、实验原理：配制分离胶（7.5%）（两组的量）：

双蒸水/mL9mL
1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）/mL5mL
Acr/Bis（30%）/mL5mL
TEMED/μL20μL
10%Aps/μL100μL
总体积/mL20mL

同台两组共用一电泳槽。
注入两玻璃夹缝中，胶面上加1cm蒸馏水（自然凝胶后倾出）。LDH染色原理PO染色示意（1）D.Virilis------------10只
（2）黑腹果蝇--P♀、P♂、F1♀、F1♂、F2♀、F2♂各40只
（3）其他材料--0.2g已配制的各种试剂：

1.组织匀浆液：100mmol/LNaCl-10mmol/LTris·HCl（pH8.0）-25mmol/LEDTA（pH8.0）
1).5mol/LNaCl
2).0.5mol/LTris·HClpH8.0
3).0.5mol/LEDTApH8.0
2.1.5mol/LTris·HClpH8.8（4℃存放）
3.0.5mol/LTris·HClpH6.8（4℃存放）
4.30%Acr/Bis：29.2gAcr+0.8gBis→双蒸水定容至100mL→过滤→4℃存放
5.上样缓冲液：0.25%溴酚蓝-40%（W/V）蔗糖水溶液
6.电泳缓冲液（室温）：5×：Tris7.5g+Gly36g→双蒸水溶解定容至500mL。使用时稀释至1×——老师配好。
要求自配[都做Est。7种样品点完剩余的3孔点普通果蝇、大果蝇、其他，用于LDH（背讲台组）、PO（面讲台组）：LDH染液[第2桌配，60mL]: PO染液[第3桌配，60mL]1.提取酶液2.4%浓缩胶的配制（两组公用量）
双蒸水/mL6.2mL
0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）/mL2.5mL
Acr/Bis（30%）/mL3mL
TEMED/μL20μL
10%Aps/μL50μL
总体积/mL10mL
加入两玻璃夹缝中，并在两玻璃板夹缝中水平插入梳子，待凝胶后小心拔出梳子（在缓冲液中拔梳子）。5．电泳：4℃冰箱中，100v。
（接近完成时配染色液！）
6.停止电泳:指示剂溴酚兰移至底部约0.5cm时，切断电源。
7.染色：小心从玻璃板中取下胶。去掉浓缩胶，将分离胶进 行染色至酶带显色。（避光，Est、LDH约20min；PO约 5~10min）
8.脱色、固定、保存：染色后的胶置于7%乙酸。