烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶.doc

实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
一、实验目的
１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N’,N’－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性
１聚合反应
聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：
=1\*GB3①AP-TEMED属化学聚合作用
=2\*GB3②核黄素－TEMED属光聚合作用
２凝胶孔径的可调性及其相关性质
=1\*GB3①凝胶性能与总浓度及交联度的关系
凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10脆硬乳白
交联度：a:b>100糊状易断
=2\*GB3②凝胶浓度与孔径的关系
T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加
=3\*GB3③凝胶浓度与被分离物分子量的关系
分子量增加阻力增加移动速度减慢。同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响
水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理
根据有无浓缩效应可分为：
连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。因而其分离带清晰度及分辨率高。
垂直板电泳：凝胶是在两块间距几毫米的平行玻璃板中聚合。
垂直圆盘电泳：凝胶是在玻璃管中聚合，样品分离区带染色后呈圆盘状。
（三）过氧化物酶染色原理
过氧化物酶催化过氧化氢释放活性氧，进一步氧化联苯胺使之由蓝色变为褐色。属于活性染色，若酶失活，则不能变色。
（四）过氧化物酶活性的测定原理
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下过氧化物酶能使愈创木酚氧化生成褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量，以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470/min.mg蛋白质表示
三实验器材
１电泳仪（600V）及盘状电泳电泳槽
２电泳玻璃管（用碱性较低的玻璃管），内径5－7mm，长80－100mm
３玻璃架
４微量注射器或微量吸管
５带长针头的注射器
６日光灯
７带有玻璃珠或玻璃棒的一小段乳胶管
四试剂和材料
１贮液和工作溶液的配制
２染色液的配制
A液：称取0.4g联苯胺，加入３ml冰醋酸，溶解后加入１７ml蒸馏水随用随配
B液：NH4ClC液：EDTA(PH6.0)D液：H2O2
按A：B：C：D＝1：1：1：８比例配制
３测酶活力所需试剂
20mmol/lKH2PO4H2O2愈创木酚100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）
反应混合液：100mmol/l磷酸缓冲液（PH=6.0）50ml于烧杯中，加入愈创木酚28l于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解。冷却后加入H2O219l混合均匀保存于冰箱中。
４酶液的制备
（１）材料：萌发３－６天的高粱玉米小麦种子
（２）步骤：称取不同植物材料幼苗茎部1g加入20mmol/lKH2PO410ml于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15min。倾出上清液，测出总体积放于冷处。
五操作步骤
１过氧化物酶活性的测定
取２只光径1cm的比色板，１只中加入反应混合液３ml、KH2PO41ml作为校零对照，另一只加入反应混合液３ml、酶提取液１ml立即开启，秒表记时，于分光光度计上测量吸光值。每隔一分钟计数一次。
（A470=------------------------）
酶活力=—————————
２凝胶的制备
（１）分离胶的制备：（小孔径凝胶）PH8.9凝胶浓度
将贮液按１号：２号：水：３号＝5ml：10ml：5ml：20ml比例混匀。用带长针头的注射器快速加入玻璃管中（或两层玻璃板之间），高度约3/4。沿壁加入3－5ml蒸馏水用于隔绝空气，使胶面平整。静置30－60min完成聚合，用滤纸吸去水分。
（２）浓缩胶制备：（大孔径凝胶）PH6.7凝胶浓度
将贮液按４号：５号：６号：７号＝３ml：6ml：3