(完整word版)小动物活体成像技术的原理及操作方法.doc

活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶基因（Luciferase）标记细胞或DNA，而荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和FITC、Cy5、Cy7等荧光素及量子点(quantumdot，QD)进行标记。
小动物活体成像技术是采用高灵敏度制冷CCD配合特制的成像暗箱和图像处理软件，使得可以直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。实验者借此可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。
由于具有更高量子效率CCD的问世，使活体动物体内光学成像技术具有越来越高的灵敏度，对肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高；另外，该技术不涉及放射性物质和方法，非常安全。因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高、实验成本低等特点，在刚刚发展起来的几年时间内，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。
一、小动物活体成像概述
1.荧光发光成像
荧光成像的标记对象较为广泛，可以是动物、细胞、微生物、基因，也可以是抗体、药物、纳米材料等。常用的有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(DsRed)及其它荧光报告基团，标记方法与体外荧光成像相似，荧光成像具有费用低廉和操作简单等优点。同生物发光在动物体内的穿透性相似，红光的穿透性在体内比蓝绿光的穿透性效率高，近红外荧光为成像观察的最佳选择。
虽然荧光信号远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。虽然许多公司采用不同的技术分离背景光，但是受到荧光特性的限制，很难完全消除背景噪音。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度较低。
尽管目前大部分高水平的文章还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。但是，荧光成像有其方便，直观，标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点，在一些植物分子生物学研究和观察小分子体内代谢方面也得到应用。对于不同的研究，可根据两者的特点以及实验要求，选择合适的方法。例如利用绿色荧光蛋白和荧光素酶对细胞或动物进行双重标记，用成熟的荧光成像技术进行体外检测，进行分子生物学和细胞生物学研究，然后利用生物发光技术进行动物体内检测，进行活体动物体内研究。
荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光。考虑到不同荧光物质的发射光谱EX（excitationspectrum）和激发光谱EM（emission8pectrum）的不同，要选择对应的激发和发射滤片。常用荧光蛋白和荧光染料的激发和发射波长见表1。
EX(mm)EM(mm)表1常用荧光蛋白和荧光染料的激发和发射波长GFP480520dsRed/RFP530600Cy5630680Cy5.5630700Cy77007802.生物发光成像
活体生物荧光成像技术是指在小的哺乳动物体内利用报告基因-荧光素酶基因表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+离子存在的条件下消耗ATP发生氧化反应，将部分化学能转变为可见光能释放。然后在体外利用敏感的CCD设备形成图像。荧光素酶基因可以被插入多种基因的启动子，成为某种基因的报告基因，通过监测报告基因从而实现对目标基因的监测。
生物荧光实质是一种化学荧光，萤火虫荧光素酶在氧化其特有底物荧光素的过程中可以释放波长广泛的可见光光子，其平均波长为560nm(460—630nm)，这其中包括重要的波长超过600nm的红光成分。在哺乳动物体内血红蛋白是吸收可见光的主要成分，能吸收中蓝绿光波段的大部分可见光；水和脂质主要吸收红外线，但其均对波长为590—800nm的红光至近红外线吸收能力较差，因此波长超过600nm的红光虽然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳动物组织被高灵敏的CCD检测到。
生物发光成像的优点可以非侵入性，实时连续动态监测体内的各种生物学过程，从而可以减少实验动物数量，及降低个体间差异的影响；由于背景噪声低，所以具有较高的敏感性；不需要外源性激发光，避免对体内正常细胞造成损伤，有利于长期观察；此外还有无放射性等其他优点。
然而生物发光也有自身的不足之处：例如波长依赖性的组织穿透能力，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性也不尽相同，其中血红蛋白是吸收光子的主要物质；由于是在体外检测体内发出的信号，因而受到体内发光源位置及深度影响；另外还需要外源性提供各种荧光素酶的底物，且底物在体内的分布与药动力学也会影响信号的产生；由于荧光素酶催化的生化反应需要氧气、镁离子及ATP等物质的参与，受到体内环境状态的影响。
二、小动物活体成像
1.制作动物模型
可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。在建模时应认真考虑实验目的和选择荧光标记，如标记荧光波长短，则穿透