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小动物活体成像技术原理及常见问题分析.pdf

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小动物活体成像技术原理及常见问题分析 活体成像技术是指应用影像学方法，在不损伤动物的前提下， 对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量 研究的技术。通过这项技术可以非侵入式、直观地观测活体动物体 内肿瘤的生长，转移、疾病的发展过程、基因的表达变化等生物学 过程。与传统剥瘤称重测量的方法相比，活体成像能够对同一种实 验对象在不同时间点进行观察，跟踪同一观察目标(标记细胞及基 因)，数据更加真实可信，成本更低，灵敏度更高。 目前活体成像技术主要采用生物发光（Bioluminescence）与荧 光（Fluorescence）两种技术，生物发光技术是用荧光素酶 （Luciferase）基因标记细胞或者DNA，而荧光技术则是应用荧光 蛋白（如GFP,RFP,Mcherry等）标记细胞或是蛋白等研究对象。其 中生物发光技术因其操作简单，反应灵敏，在肿瘤，分子互作及信 号传导等研究中得到了广泛应用。 LUC荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的 酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫（Photinus pyralis）体内的荧光素酶。萤火虫荧光素酶属于加氧酶 （oxygenase），其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A（CoA） 存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译 后修饰，即可表现出荧光素酶活性。将萤火虫荧光素酶的基因插入 慢病毒介导的载体中，通过CAG启动子过表达从而作为报告基因， 在细胞中表达。常用于细胞标记后小动物细胞移植活体成像追踪， 从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。 GFP绿色荧光蛋白1962年在一种学名Aequoreavictoria的水 母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发 下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质 Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子（Ca2+）可产生交互 作用。将绿色荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过 flap-Ub启动子过表达从而作为报告基因，在细胞中表达。常用于 细胞标记后移植追踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果 等。 RFP红色荧光蛋白，目前使用的是mCherry一种来自于蘑菇珊 瑚（mushroomcoral）的红色荧光蛋白，常有于标记和示踪某些分 子和细胞组分。相对于其他荧光，mCherry的好处在于它的颜色和 应用最多的绿色荧光蛋白（GFP）能进行共同标记，并且mCherry相 对于其他单体荧光蛋白来说也具有卓越的光稳定型。本产品将红色 荧光蛋白的基因插入慢病毒介导的载体中，通过flap-Ub启动子过 表达从而作为报告基因，在细胞中表达。常用于细胞标记后移植追 踪，从而评估移植后细胞的归巢以及治疗效果等。 小动物活体成像技术原理 1.标记原理 哺乳动物生物发光，是将Fluc基因整合到细胞染色体DNA上以 表达荧光素酶，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素 （luciferin），即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP及氧 气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在 活细胞内才会产生发光现象，并且光的强度与标记细胞的数目线性 相关。对于细菌，lux操纵子由编码荧光素酶的基因和编码荧光素 酶底物合成酶的基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光，不 需要外源性底物。 1.1.生物发光成像系统组成 体内可见光成像系统主要由三局部组成 [1]CCD镜头：选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常 重要的。 [2]成像暗箱：像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源,可以使暗箱内部保 持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，防止外 界环境的光污染。 [3]软件系统：软件系统负责仪器控制和图像分析。 1.2.标记细胞的方法 通过分子生物学克隆技术,将荧光素酶的基因插到预期观察的细 胞的染色体内，通过单克隆细胞技术的筛选，培养出能稳定表达荧 光素酶的细胞株。 1.3结果观察 将标记好的细胞注入小鼠体内后,观测前需要注射荧光素酶的底 物一荧光素,为约280道尔顿的小分子。注射一次荧光素能保持小鼠 体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。应用一个高度灵敏的制 冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件。 2.光学原理 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜 和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子 的特性并不一样。在偏红光区域,大量的光可以穿过组织和皮肤而 被检测到。在相同的深度情况下,检测到的发光强度和细胞的数量 具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可